初期の椎間板疾患をシミュレートするための炎症誘発性臓器培養モデルの生成

要約

出典:Saravi, B., et al. A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、バイオリアクターでウシの椎間板を培養し、3次元臓器培養モデルを開発する技術を紹介しています。特定の栄養不足培地と変性圧力条件が椎間板に適用され、初期段階の椎間板疾患で観察される炎症誘発性および変性微小環境を模倣しています。椎間板の高さは、栄養欠乏と変性負荷の影響を分析するために、処理後に測定されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ウシ椎間板の解剖

1. テール全体を水道水でよくすすいで、表面の汚れや毛を取り除きます.
   手記：遠位端が無傷の場合、IVDの所望のサイズに応じて、尾ごとに最大9個の椎間板(IVD)(尾骨1-9)を実験に使用できます。15〜20 mmの望ましい直径を考慮して、実験には12個のウシの尾と1尾あたり5個のIVDを使用しました。
2. 1%ベタジン溶液が入った箱にテール全体を10分間浸し、テールを滅菌ガーゼで短時間乾燥させ、滅菌ドレープの上に置きます
   手記：椎間板の解剖中は、脱水症状を防ぐために、リンガー溶液湿式ガーゼで尾部を加湿します。.テール(または残りのセグメント)を濡れたガーゼで包んで、全体の解剖手順が完了するまで保管してください。
3. メス(No.20)を使用して、尾側脊椎から軟部組織をできるだけ完全に除去し、IVDの識別を容易にします。骨除去プライヤーで椎骨の棘突起と横突起を取り除きます.
   手記：希望の直径のIVDを選択します。今回の研究では、直径範囲が15〜20mmのIVDが使用されました。
4. 各椎体の中央を骨ペンチで横方向に切断し、個々の運動セグメントを取得します。モーションセグメントをペトリ皿に入れ、ガーゼをリンガー溶液で濡らします。
5. 触診とモーションセグメントを優しく動かすことにより、IVDと椎骨を特定します。IVDの成長プレートにバンドソーを使用して、IVDの両側に1つずつ、2つの平行なカットを行います。IVDから椎骨に向かって約0.5〜1mmの安全距離で、椎間板(軟)に隣接する骨端板部分(硬質)の凸状部位に触れて見つけることにより、成長板の位置を特定します。椎骨を切断しながら、バンドソーの刃がリンガー溶液で冷却されていることを確認してください。
6. リンガー液で濡らした清潔なガーゼで清潔なペトリ皿でIVDを移します.
   手記：ガーゼは、IVDの腫れを防ぐために湿らせ、濡れすぎないようにする必要があります。
7. メスの刃を使用して、椎体(赤/ピンクの骨)、成長板(白い軟骨)をこすり落とし、端板をそのまま残します(黄ピンク)。荷重手順のために、2つのサーフェスを平らで平行にします。削ったIVDをガーゼをリンガー液で濡らした新鮮なペトリ皿に移します.
   手記：IVDを保持してこすり落としながら手を保護するためにチェーンメイルグローブを着用してください。
8. キャリパーでディスクの高さと直径を測定します。ジェット洗浄システムを使用して、リンガー液で椎骨の血栓を洗浄します。
9. IVDを50 mLのプラスチックチューブ(チューブ1本につき1本)に移します。IVDごとに25 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)+ 10%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を加え、室温のオービタルシェーカーで15分間振とうしておきます。
10. 上清を吸引し、IVDあたり10 mLのPBS + 1%P / Sを2分間追加して、IVDをすすぎます。

>2. IVDの培養とローディング

1. ディスクをIVDチャンバーに移し、IVD培地(ダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM、生理学的グループには4.5 g / L高グルコースDMEM、病理学的グループには2 g / L低グルコースDMEM)+ 1% P / S + 2%ウシ胎児血清+ 1% ITS(5 μg / mLインスリン、6 μg / mLトランスフェリン、 および 5 ng/mL セレン酸) + 50 μg/mL アスコルビン酸-2-リン酸 + 1% 非必須アミノ酸 + 50 μg/mL 初代細胞用抗菌剤) をインキュベーターに入れ、37 °C、湿度 85%、CO₂ 5% のインキュベーターに入れます。
2. 実験グループに従って、バイオリアクターシステム内でディスクを4日間培養します。病理学的グループでは、0.32-0.5 MPa、5 Hzで2時間/日の変性負荷条件を維持します。生理学的対照群では、0.02-0.2 MPa、0.2 Hzの負荷プロトコルを2時間/日使用します。
   手記： ローディング手順では、IVDを5 mLのIVD培地が入ったチャンバーに配置します。容量は、バイオリアクターのローディングチャンバーのサイズによって異なります。ローディング手順の合間に、IVDを7 mLのIVD培地を入れた6ウェルプレートに入れて、自由に膨潤回復させます。
3. 実験期間中の椎間板の高さの変化を分析するには、IVD 解剖後 (ベースライン) と、自由腫脹期間後および実験期間中の動的負荷後に毎日、キャリパーで椎間板の高さを測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アスコルビン酸-2-リン酸	Sigma-Aldrich、セントルイス、米国	A8960
帯鋸	Exakt Apparatebau, ノルダーシュテット, ドイツ	モデル 30/833
ベタジン	Munndipharma、フランクフルト、ドイツ
コーニングITSプレミックス	Corning Inc.、ニューヨーク、米国	354350
DMEM高グルコース	Gibco by life technologies、カールスバッド、米国	10741574
DMEM低グルコース	Gibco by life technologies、カールスバッド、米国	11564446
分子生物学用エタノール	Sigma-Aldrich、セントルイス、米国	09-0851
ウシ胎児血清(FBS)	Gibco by life technologies、カールスバッド、米国	A4766801
非必須アミノ酸溶液	Gibco by life technologies、カールスバッド、米国	11140050
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)	gibco by life technologies、カールスバッド、米国	11548876
リン酸緩衝液、錠剤	Sigma-Aldrich、セントルイス、米国	P4417
プリモシン	InvivoGen、サンディエゴ、米国	アント-PM-05
Pulsavac ジェット ラベージ システム	ジマー、インディアナ州、米国

の 型