マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

Abstract

出典:Hubbard, K. et al., Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem-Cell-derived Central Nervous System Neurons.J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、胚性幹細胞を機能しているシナプスを持つニューロンのネットワーク集団に分化する技術を示しています。胚性幹細胞のニューロンへの分化、ニューロンネットワーク形成の誘導、およびネットワーク化されたニューロンによる培養の濃縮に関与するステップを概説しています。

Protocol

1. ニューロンの分化

>注: ステップ 1.1 から 1.5 は正午までに、ステップ 1.7 は正午以降に行ってください。鑑別手順の概要を図 1A に示します。

1. 350 μl (3.5 x 10⁶) の ESC を 25 ml の分化培地が入った 10 cm の低付着皿に移します。組織培養インキュベーター内で30〜45rpmに設定されたオービタルシェーカーに、37°Cで5%_CO2を入れます。これは分化の最初の日であり、in vitro (DIV) -8.
   と呼ばれます 手記：超低アタッチメントディッシュを使用すると、メソッドのコストが増加しますが、凝集体がペトリディッシュに付着することがあるため、細菌のペトリディッシュよりもわずかに大きな収率が得られます。異なるディッシュサイズが望ましい場合は、それに応じて中容量とセル数をスケーリングできます。
2. 48時間後(DIV -6)、25 mLのピペットを使用して、分化した細胞凝集体を50 mLのコニカルチューブに移します。すぐに新鮮な25mlの分化培地をペトリ皿に加えます。
3. 骨材が2〜5分かけて沈降するのを待ち、深さ1〜2mmの目に見えるペレットを生成します。懸濁液に残っている単一細胞または小さな凝集体は無視してください。培地を慎重に吸引し、P1000を使用して細胞ペレットをペトリ皿に戻します。組織培養インキュベーターのロータリーシェーカーに置きます。
4. DIV -4 で、手順 1.2 を繰り返します。ペレットの深さは2〜4mmです。6 μM オールトランスレチノイン酸(RA)を添加した 30 mL の分化培地をペトリ皿に交換します。組織培養インキュベーターのロータリーシェーカーにさらに48時間戻ります。
5. DIV -2 で、手順 1.3 を繰り返します。この時点で、ペレットの深さは4〜8mmになります。
6. DIV-1では、セクション2と同様にめっき面を準備します。
7. DIV 0で、分注して凍結したNPCトリプシン化培地5 mLを37°Cで5〜10分間解凍し、組織培養フードに入れます。25 mLのピペットを使用して、分化凝集体を50 mLのコニカルチューブに移します。骨材が沈殿するのを待ち、培地を慎重に吸引します。ペレットを10 mlのPBSで2回洗浄し、洗浄の合間に凝集体が沈殿するようにします。
8. 2回目のPBS洗浄後、5 mLのNPCトリプシン化培地をペレットに加え、37°Cで5分間インキュベートします。
9. 0.1%大豆トリプシン阻害剤(STI)を5ml加えてトリプシンを不活性化し、反転させて混合します。10 mLの血清学的ピペットで10〜15回、比較的均質な細胞懸濁液が生成されるまで、穏やかに粉砕します。
10. 細胞懸濁液を、50 mLの円錐形チューブの上に置いた40 μmまたは70 μmの細胞ストレーナーにゆっくりと移します。すべての懸濁液をろ過したら、1 mLのN2培地を加えて残りの細胞をフィルターで洗浄し、解離した細胞懸濁液を200 x gで6分間ペレット
化します。
11. ペレットを乱さずに培地を吸引します。細胞を10 mLのN2培地で2回洗浄し、200 x gで5分間細胞をペレット化し、P1000で洗浄の合間にトリチュレートします。2回目の洗浄の前に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
12. N2培地に細胞を1 x 10⁷細胞/mLで再懸濁し、細胞密度150,000 - 200,000細胞/cm²でESNをプレート
化します。
13. 新たに播種したESNを加湿組織培養インキュベーターに37°C、5%CO₂で移し、セクション3と同様に維持します。

2. DIV 0で神経前駆体をプレーティングするための培養表面の準備

1. 組織培養処理した皿は、めっきの少なくとも1日前に調製してください。十分なポリエチレンイミン(PEI;滅菌H₂Oで25 μg/ml)またはポリ-D-リジン(PDL;滅菌H₂Oで100 μg/ml)を添加して、組織培養処理プラスチック皿を覆い、O/Nを37°Cでインキュベートします。
2. メッキの朝に、再蒸留した_H2Oで2回、PBSで1回皿を洗います。最終洗浄後、ディッシュを覆うのに十分なN2培地を追加します(例:12ウェルディッシュのウェルあたり1 ml、または6 cmディッシュあたり4 ml)。
3. ニューロンめっきの少なくとも1日前に18mmのガラスカバースリップを準備します。4分間プラズマクリーニングでカバースリップを清掃します。
4. 洗浄したカバースリップを、大きな滅菌皿の底にあるエタノール洗浄パラフィルムに直ちに移し、ステップ2.1で調製したPEIまたはPDL溶液400μlを加えます。O/Nを組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
5. 午前中に、カバースリップを水で3回洗浄し、PBSに5μg/mlのラミニンを37°Cで1〜3時間加えます。ニューロンを解離する前に、ラミニンを吸引し、すぐにカバースリップをNPC培地1mlを含む12ウェルディッシュのウェルに移します。
6. NPCが皿に盛り付ける準備ができるまで、皿とカバースリップを37°Cで保管します。

3. ニューロンの維持

1. DIV 1では、培地を吸引し、N2培地と交換します。
2. DIV 2および4では、培地を吸引し、B27培地と交換します。
3. DIV 8では、培地を吸引し、有糸分裂阻害剤を含むB27培地と交換して、汚染された非神経細胞を排除します。
4. DIV 12で、B27培地と交換します。
5. 使用する準備ができるまで、5% CO₂からDIV 12⁺ ESNを取り外さないでください。

Results

図 1.懸濁適応ESNは有糸分裂的に安定なままであり、多能性のマーカーを発現します。(A)ESCのメンテナンスと差別化の概略図。レチノイン酸(RA)または白血病抑制因子(LIF)の有無は、+または-で示されます。初代ニューロン培養のin vitro(DIV)と古典的発生段階(DS)の比較を提供します。(B)R1、D3、C57BL/6J ES細胞株の増殖速度は、浮遊培養に移行後5継代で安定します。(C)フローサイトメトリーのデータは、懸濁培養で25継代にわたって測定したR1、D3、およびC57BL/6J ES細胞株におけるOct3/4発現に実質的な変化を示していません(それぞれn = 6)。(D)懸濁液に適合したR1 ESCラインのルーチン継代中...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジー	〒10829-018	メディア:ESC培地 製剤と注意事項:500 mL
100x MEM NEAA	ライフテクノロジー	11140-050	培地:4°Cで最大1ヶ月間保存 処方と注意事項:6mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	6ミリリットル
ES認定FBS	応用幹細胞	ASM-5007	90ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	3ミリリットル
55 mM 2-メルカプトエタノール	ライフテクノロジー	21985年023月	1.1ミリリットル
107 ユニット/mL LIF	ミリポア	ESG1107	60μL
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジー	〒10829-018	メディア:ESC分化培地 製剤とノート:436.6 mL
100x MEM NEAA	ライフテクノロジー	11140-050	培地:4°Cで最大1ヶ月間保存 処方と注:5 mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	5ミリリットル
ESC認定美容液	応用幹細胞	ASM-5007	50ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
55 mM 2-メルカプトエタノール	ライフテクノロジー	21985年023月	0.9ミリリットル
ダルベッコのPBS	シグマ・アルドリッチ	D8537	メディア:NPCトリプシン化培地 製剤とノート:100 mL
0.5 M EDTA(18.3%)	シグマ・アルドリッチ	3690	培地:5 mLアリコートで凍結 製剤と注:0.266 mL
トリプシン	シグマ・アルドリッチ	T8802	50ミリグラム
ポリエチレンイミン(PEI)	シグマ・アルドリッチ	P3143	メディア:表面コーティング溶液 配合と注意事項:H20で2.5μg / mL
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマ・アルドリッチ	P7280	培地:1週間以内に使用 製剤と注意事項:H20で100 μg/mL
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020	H20 で 5 μg/mL
DMEM/F12 + グルタMAX	ライフテクノロジー	〒10565-018	培地:NPC培地 製剤とノート:492.5 mL
100x N2ビタミン	ライフテクノロジー	17502-048	培地:4°Cで最大1ヶ月間保存 処方と注:5 mL
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
神経基礎A	ライフテクノロジー	〒10888-022	培地:ESN培地 製剤と注:482.5 mL
50x B27ビタミン	ライフテクノロジー	17504-044	培地:4°Cで最大1ヶ月間保存 処方と注:10mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	5ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FDU)	シグマ・アルドリッチ	F0503	メディア:2000x Mytotic inhibitors aliquot and save at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. 滅菌フィルター、分注、凍結。ESN培地に2000xを使用してください。
ウリジン	シグマ・アルドリッチ	U3003
TrypLE Expressトリプシン	ライフテクノロジー	〒12605-010	メディア:その他の調合と注:RTで保管
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D8418	RTでストア
大豆トリプシン阻害剤(STI)	シグマ・アルドリッチ	T6414	-20°Cで保存
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023	RTでストア
アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A4403の	100 mgのアスコルビン酸を5.7 mLの50:50 DMSO/エタノール混合物に溶解して、100 mMストックを調製します。
レチノイン酸(RA)	シグマ・アルドリッチ	R2625	15 mg RAを9 mL 50:50 DMSO/エタノールに再懸濁します。100 mMアスコルビン酸ストック1 mLを補給します。分注し、-80°Cで保存し、6ヶ月間安定です。
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-32Gの
オリンパス IX51 倒立顕微鏡	オリンポス	該当なし
18 mmガラスカバースリップ	漁夫	12-545-84
セルストレーナー(40μm)	漁夫	08-771-1
ストーバルベリーダンサーシェーカー	漁夫	15-453-211
低接着ディッシュ	漁夫	05-539-101	コーニング3262
バクテリア皿	VWRの	25384-302	100 x 15ミリメートル