マウス坐骨神経からのシュワン細胞の磁気分離

要約

出典: Blusch, A., et al., ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のインビトロ髄鞘形成

。

このビデオでは、マウスの坐骨神経線維からシュワン細胞を単離する方法を実演しています。

プロトコル

1. シュワン細胞培養

1. シュワン細胞培養用コーティング
   1. 細胞培養皿を無菌状態でコーティングします。0.01%ポリ-L-リジン(PLL)2 mLを60 mm組織培養(TC)皿2枚にそれぞれ適用し、4°Cで一晩インキュベー
   トします。
   2. PLLを取り外し、TCディッシュを蒸留水で2回洗浄し、2mLの1μg/cm²ラミニンと4°Cで一晩インキュベートします。
2. シュワン細胞培養用の培地調製
   1. 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2 μMフォルスコリン、10 nMニューレグリン、および50 μg/mLゲンタマイシンを無菌条件下でダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F-12(高グルコース)に添加して、50 mLのシュワン細胞培地を調製します。
   2. 無菌条件下で、50 μg/mLのゲンタマイシンを含むLeibovitzのL-15培地70 mLを調製します。
3. 坐骨神経の酵素的消化
   注:次のステップは無菌条件下で実行されます。
   1. 10 mLのDMEM(高グルコース)に0.25%ディスパーゼII、0.05%I型コラゲナーゼ、および50 μg/mLのゲンタマイシンを含む酵素消化溶液を調製します。
   2. チューブを188 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、25 mLの血清ピペットで上清を除去し、残りのLeibovitzのL-15培地を入れたペレットを1,000 mLピペットを使用して60 mmの組織培養皿に移します。
   3. 50mLのチューブを10mLの酵素消化液ですすぎ、神経線維を含む皿に加えます。ピペットの先端で皿内のティッシュを注意深く分散させ、消化しやすい表面を最大化します。
   4. 37°C、5%CO₂で18時間インキュベートし、Ca²⁺およびMg²⁺を含まないHanksの平衡塩溶液に10 mLの40% FCSを加えて消化を停止します(HBSS)。
4. 細胞分離
   1. 消化した神経を血清学的ピペットを使用して50mLチューブに移し、188 x gで4°Cで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、10%FCSと50μg / mLゲンタマイシンを含むDMEMの10mLにペレットを再懸濁します。.その後、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL、および200 μLのピペットチップを使用して、ペレットを20回再懸濁します。
   2. 100 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液を濾過し、188 x gで4°Cで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、10% FCSと50 μg/mLのゲンタマイシンを含む4 mLのDMEMでペレットを再懸濁します。
   3. 2つのPLLおよびラミニンコーティングされた60 mm TCディッシュのそれぞれに2 mLの細胞懸濁液を加え、37°Cおよび5%_CO2でインキュベートします。プレートをインキュベーター内で2日間放置して、細胞を機械的ストレスから保護し、接着をサポートします。
5. シュワン細胞分化
   1. 2日後、培地を取り出し、DMEM(高グルコース)、10%FCS、および50μg/mLのゲンタマイシンでプレートを2回慎重にすすぎます。その後、2 mLのシュワン細胞培地を加えます。シュワン細胞培地を2日ごとに交換し、顕微鏡を使用して細胞の外観と密度を観察します。
6. 細胞のトリプシン化と磁気分離
   1. 細胞が約80%(6〜12日間の培養)のコンフルエントに達したら、プレートを3 mLのDPBSで2回慎重に洗浄し、2 mLの0.05%トリプシン/ EDTA(37°Cに予熱)で3分間インキュベートします。細胞がプレートの底から剥離したら、10% FCSを含む2 mLのDMEMと50 μg/mLのゲンタマイシンを加えて消化を不活性化します
      手記：トリプシン化時間は厳密に3分に固執し、その後急速に進行します。
   2. 0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および2 nM EDTAを含むDPBSを含む2 mLの磁気細胞分離バッファーに細胞ペレットを再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを組み合わせ、染色チャンバーを使用して細胞をカウントします。
   3. 細胞懸濁液を188 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを1 x 10⁷細胞あたり90 μLの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。1 x 10⁷細胞あたり10 μLのThy-1マイクロビーズを添加します。溶液を数回再懸濁し、8°Cの暗所で15分間インキュベートします。
   4. 2 mLの磁気細胞分離バッファーを細胞懸濁液に加え、300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500 μLの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。
   5. 磁気細胞分離カラムを1 mLの磁気細胞分離バッファーで湿らせます。磁気セル分離カラムを磁気セルセパレーターに入れます。セルを磁気セル分離カラムに適用します。流流を収集し、300 x g、4°Cで10分間遠心分離します
      手記：線維芽細胞は正に選択され、カラムに留まりますが、シュワン細胞はカラムを通過します。線維芽細胞は、スタンプで収集できます(例:Schwann細胞染色プロトコルのネガティブコントロールとして)。
   6. 上清を捨て、ペレットを共培養培地1mLに再懸濁します。トリパンブルーと染色チャンバーで染色した後、細胞をカウントします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン	カール・ロート、カールスルーエ、ドイツ	8076.4
セルストレーナー、100 μM	BD Bioscience、ハイデルベルク、ドイツ	352360
遠心分離機 5810-R	Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ	5811000015
CO2インキュベーター Heracell	ヘレウス・インスツルメンツ社(ドイツ・ハーナウ)	51017865
ディスパーゼII	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	4942078001
蒸留水(浄水装置)	ミリポア、モルスハイム、フランス	ZLXS5010Y
DMEM/F-12、グルタMAX	サーモフィッシャーサイエンティフィック、シュヴェルテ、ドイツ	31331093
DPBS(カルシウムイオン、マグネシウムイオンなし)	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	D8537-6×500ミリリットル
FCSの	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	F7524	FCSはシュワン細胞培養のために試験する必要があります
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック、シュヴェルテ、ドイツ	5710064
HBSS(カルシウムイオン、マグネシウムイオン不使用)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、シュヴェルテ、ドイツ	14170138
ラミニン	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	L2020-1MG
MACSマルチスタンド	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	130042303
マイクロハサミ	Fine Science Tools GmbH、ハイデルベルク、ドイツ	15000から08
顕微鏡	Motic、ヴェッツラー、ドイツ	モティックBA 400
顕微鏡スライド	VWR, Radnor, アメリカ	630-1985
MiniMACSセパレーター	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	130091632
MS カラム	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-042-201
ノイバウアー計数室	アシスタント、エアランゲン、ドイツ	40441
ピペット	Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ	2231300004
ポリ-L-リシン	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	P4707-50ミリリットル
血清ピペット、10 mL	ザルシュテット、ニュンブレヒト、ドイツ	861254025
血清ピペット、25 mL	ザルシュテット、ニュンブレヒト、ドイツ	861685001
血清ピペット、5 mL	ザルシュテット、ニュンブレヒト、ドイツ	861253001
TCディッシュ60、セル+	ザルシュテット、ニュンブレヒト、ドイツ	833901300
Thy-1 マイクロビーズ (MACSキット)	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-094-523
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック、シュヴェルテ、ドイツ	〒25300-054
I型コラゲナーゼ	Sigma Aldrich GmbH、シュタインハイム、ドイツ	C1639
ウォーターバスタイプ1008	GFL, Burgwedel, ドイツ	4285

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