水平マウス海馬脳スライスの取得

要約

出典:Van Hoeymissen, E., et al.マウスの脳の水平な海馬スライス。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、海馬線維経路の完全性を維持することに焦点を当てた、マウスからの水平海馬脳スライスを準備するための詳細なプロトコルを示しています。このプロセスでは、脳を慎重に二等分して固定し、ビブラトームを使用してスライスし、カルボゲン化液体で最適な組織状態を維持し、海馬の脳スライスをさらに実験する準備が整います。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 高ショ糖スライス液と人工脳脊髄液(ACSF)の調製

1. 実験日の前に
   1. 1 Lの10xスライス調製溶液を、25 KCl、20 CaCl₂、10 MgSO₄、12.5 KH₂PO₄(表1)を含むラボグレードのタイプ1水で調製します。リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、マグネチックスターラーで絶えず攪拌しながら、800 mLのH₂Oをあらかじめ充填したビーカーで化学物質をゆっくりと混合します。溶液は4°Cまたは室温(RT)で保存してください。
2. 実験当日
   1
   1. L の 1x ACSF を、125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl₂、1 MgSO₄、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、25 グルコースを含むラボグレードの Type 1 水で調製します(表 2)。蒸気圧浸透圧計を使用して、305〜315 mOsm(pH~7.55〜7.6).
      の浸透圧を検証します。 手記：リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、マグネチックスターラーで絶えず攪拌しながら、800 mLのH₂Oをあらかじめ充填したビーカーですべての固体化学物質をゆっくりと混合します。最後にMgSO₄とCaCl₂を添加し、1 Mストック溶液から必要な量をゆっくりと滴下します。
   2. 1x ACSF溶液をRTでカルボゲンと連続的にバタリングし、pHを7.3〜7.4.
      に設定します。 手記：pHがわずかに高すぎたり低すぎたりする場合は、カルボゲン化強度を少し調整するだけで十分です。カルボゲン化によりpHが7.45より高い場合は、1 M NaH₂PO₄溶液を数滴加えて調整します。
   3. 25 mLの10xスライス前溶液と(mM単位)を含むビーカーに、250 mL(脳あたり)の1x高スクローススライス溶液を調製します:252ショ糖、26 NaHCO₃、および10グルコース(表3)。浸透圧が320〜325 mOsm(pH~7.55〜7.6)であることを確認します。
   4. 高ショ糖スライス溶液をカルボゲンで10〜15分間泡立てて、pHを7.3〜7.4.
      に制御します 手記：pHがカルボゲン化で7.45より高い場合は、1 M KH₂PO₄溶液を数滴加えて調整します。
   5. 高スクローススライス溶液をウルトラフリーザー(-80°C)で20〜30分間、部分的に凍結するまで保存します。

2. マウス脳の解剖と位置決め

1. 冷やした35mm培養皿に脳を移し、ACSFを充填したパスツールピペットで脳を優しく洗浄することにより、組織からすべての髪または血液粒子を取り除きます(血液は脳組織に細胞毒性作用があります)。
2. 冷やした90mm培養皿の上の浸した濾紙の上のへらの助けを借りて脳を移します(図1A)。
3. ブレードを使用して脳を半分に切り、2つの半球を分離し、両方の半球を切りたての内側に置きます。
4. ブレードを使用して、背側の上部に平行に切り込みを入れて各半球から脳の背側部分(5%〜10%)を取り外し(図1C)、脳の腹側を上に向けて、切りたての側に両方の半球を置きます。
5. 瞬間接着剤を試料プレートに一滴垂らし、ピペットチップで両半球に適切に広げます。
6. 濾紙ストラップを使用して、濾紙ストラップで腹側に触れることで毛細管現象で片方の半球を持ち上げ、組織を傷つけないようにします。
7. 別の濾紙ストラップを使用して、脳の背側を慎重に半乾かしてから、半球、背側を下にして、標本プレートの接着剤の上に置きます。2 番目の半球で同じ手順を繰り返します.
   手記：半球は、ビブラートプレート上に鏡面状に水平に整列して配置し、吻側の側面が外側を向き、尾側の側面が中央で互いに向き合う(ただし接触しない)ようにします。両半球の内側はビブラトームブレードを、外側は実験者を向く必要があります(図1D)。
8. 試料プレートをスライスチャンバーに置き、氷冷した高スクローススライス溶液スラッシュですばやく、しかし慎重に覆います。溶液が接着剤に触れるとすぐに、溶液は固まり、半球が試料プレートに適切に接着されます。
9. 半球が高ショ糖スライス溶液で適切に覆われていることを確認し、溶液がカルボゲンで泡立っていることを確認します.
   手記：解剖手順全体は、できるだけ早く実行する必要があります。脳が酸素の供給なしに非常に長時間滞在しないようにしてください。斬首から高ショ糖スライス溶液スラッシュへの脳の沈没まで、約1〜1.5分しかかかりません。これは、高品質のスライスを保証するための急性脳スライス調製の最も重要な要件です。

3. 脳の水平スライス

1. ビブラトームブレードを半球の内側の前に置き、上を向いている半球の腹側と同じ高さまで下げます。ビブラトームコントロールを使用してブレードを背側方向にさらに600μmまで下げ、スライスを開始します。ブレードが組織に当たるはずです(そうでない場合は、ブレードを逆にしてもう少し下げます)。最初の 2 つのスライスが 2 つの半球から完全に分離されるまでスライスします。
2. ブレードを裏返し、さらに300μm下げて再度スライスします。
3. 海馬が見えてきたら(必要に応じてマウスの脳地図を使用してください)(図1E)、幅を広げたプラスチック製のパスツールピペットでスライスを収集します。尾状被殻が海馬の隣に見えるようになるまで、スライスを収集します。通常、マウスの脳のために300μmのスライスを8〜12枚(半球あたり4〜6枚)収集できます。
4. プラスチック製のパスツールピペットを使用してスライスを収集し、ウォーターバス(図1F)の回収チャンバーに移します(スライスの各ラウンドの後にスライスを収集して、スライスチャンバー内で浮遊しないようにします)
   手記：できるだけ早く作業し、全手順で高ショ糖スライス溶液が氷のように冷たく、カルボゲン化されていることを確認してください。必要に応じて、スライスチャンバーを囲む氷を補充します。

>4. 電気生理学的記録のための脳切片の回復

1. スライスを ACSF で満たされた回収チャンバーに 32 °C のウォーターバスで 1 時間放置します
   注:回収チャンバーも市販されています。
2. リカバリーチャンバーをウォーターバスから取り出します。
3. スライスをRTに少なくともさらに30分間置いてから、さらにアプリケーションを開始します。

>Buffer と Media Recipes.

>表1:10 x スライス前溶液(1 L)。

名 名 銭 名 銭

化合物	濃度(mM)	分子量(g / mol)	内容量(g)
KClの	25	74円55銭	1.86
CaCl2 * 2H2O	20	147円01	2.94
MgSO4 * 7H2O	10	246.48	2.46
KH2PO4	12.5	136円08	1.7

>表2:1x ACSF(1 L)(浸透圧305〜315 mOsm)。

の 名 の 銭 名 銭 名 %

化合物	濃度(mM)	分子量(g / mol)	内容量(g)
NaCl	125	58円44銭	7.3
KClの	2.5	74円55銭	0.19
CaCl2 * 2H2O	2	1 M CaCl2溶液から	2ミリリットル
MgSO4 * 7H2O	1	1 M MgSO4溶液から	1 mL
NaH2PO4 * 2H2O	1.25	156円02	0.2
NaHCO3	26	84円01	2.18
グルコース* H2O	25	198円17銭	4.95

>表3:1倍高ショ糖スライス溶液(250mL)(浸透圧320〜325 mOsm)。

名 名 銭 名

化合物	濃度(mM)	分子量(g / mol)	内容量(g)
10倍スライスプレゾリューション	該当なし	該当なし	25ミリリットル
蔗糖	252	342.3	21円57銭
NaHCO3	26	84円01	0.55
グルコース* H2O	10	198円17銭	0.49

結果

図1:水平海馬脳切片の調製に関する詳細情報。 (A)げっ歯類の脳の解剖とスライスに必要な道具の画像:(a)長さ±2cm、幅±0.5cmの濾紙のストラップ(例:グレード413)。(b)ブレード;(c)瞬間接着剤;(d)ピペットチップ;(e)標本プレート(ビブラートが付属)。(f)35mm培養皿;(g)細いブラシ。(h) へら;(i)湾曲した鉗子。(j) 解剖用ハサミ。(k)強力なはさみ(刃の長さが10cmを超える)。(l)広い開口部(直径0.6〜0.8cm)のプラスチック製パスツールピペット。(m)回収チャンバー(250mLビーカー、プラスチックリング、ナイロンメッシュ、10mL血清ピペットのピースで自作);(n)冷やした培養皿の上に氷と(o)正方形の濾紙で満たされた90mmの培養皿。(B)氷で満たされたスライスチャンバーのホルダーを備えたビブラトームの写真。(b)スライスチャンバー。(c)カルボ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルボゲンタンク	エア・リキード	アルファガズミックスB50	混合ガスCO2/O2:5/95、純度5
培養皿(35mm)	コーニング ライフサイエンス	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon-Cell-Culture-Dishes®/p/353001
培養皿(90mm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
湾曲した鉗子	ファインサイエンスツール	11270から20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-(+)-グルコース一水和物	シグマ・アルドリッチ	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE
濾紙	VWRの	〒516-0818	グレード413
細いブラシ	ラファエル・ケーレル	8204	サイズ #1
ロックタイト406	ヘンケルの接着技術	ロックタイト406	瞬間接着剤
塩素酸カリウム	ケムラボ	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
リン酸二水素カリウム	メルク	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
半球を準備するためのカミソリの刃	SPIサプライ	安全カートリッジディスペンサー - Pkg/10	GEM Scientific シングルエッジカミソリブレード
ビブラトーム用カミソリ刃	テッド・ペラ・インク	121から6	ダブルエッジブレークスタイルカミソリブレード(PTFEコーティングされたステンレス鋼)
回収室	自家製 - ジェネリック	該当なし	脳のスライスを収集して保存するには(原稿の詳細を参照)
鋏	どの会社でも	該当なし	刃はよく研がれ、斬首を容易にするために少なくとも15cmの長さである必要があります
リン酸二水素ナトリウム二水和物	メルク	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
炭酸水素ナトリウム	アルファ・アエサル	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
塩素酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
スパーテル	シグマ・アルドリッチ	S9147-12EA	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE
蔗糖	VWRインターナショナル株式会社	102745C	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
カルボゲン、灌流、吸引ライン用チューブ 1	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0167	標準バルブシステム用のタイゴンチューブ(TY-50)
カルボゲン、灌流、吸引ライン用チューブ 2	フィッシャーサイエンティフィック	800/100/200 & 800/100/280	スミスメディカルポルテックスファインボアLDPEチューブ
ビブラトーム	ライカ	14912000001	半自動振動ブレード ミクロオーメイ VT1200
ウォーターバス	メメルト	WNBの7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
浄水システム	メルク	シナジーミリポア	高度に精製された水を得るために