出典:Bosch, D., et al.脳スライスの恐怖回路のEx Vivo光遺伝学的解剖。J. Vis. Exp.(2016年)
このビデオは、マウスの脳から傾いた扁桃体スライスの生成を示しています。脳はビブラトーム標本ステージ上で斜めに配置され、扁桃体とシナプス接続を形成する内側前頭前野からの扁桃体と軸索を含むスライスを取得します。脳切片は生理学的温度に維持され、さらなる実験のために組織を保存します。
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方法論記事
マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 急性スライスの調製
- 人工脳脊髄液(ACSF)、切削液、工具(ハサミ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット)、寒天ブロックを準備します><。 注:1回の実験につき1Lの人工脳脊髄液(ACSF)が必要であり、以前に発表されたように、化学物質を二重蒸留H2Oに溶解することによって調製されます。切断液は、200 mLのACSFに0.87 mLの2 M MgSO4ストック溶液を添加して調製します。
- 実験全体を通してACSFと切断溶液を95%O2および5%CO2で酸素化します。
- イソフルラン(酸素中3%)を用いた小動物麻酔器を用いてマウスに深く麻酔をかけます。続行する前に、四肢離脱反射を使用して麻酔の深さを確認してください。
- 大きなハサミを使用してマウスの首を切り、すぐに氷冷した切断液で頭を冷やします。
- 尾側から吻側への正中線を1回切開して頭蓋骨を開き、鉗子を使用して頭蓋骨の断片を側面にそっと押します。小さく丸みを帯びたヘラを使用して頭蓋骨から脳をそっと持ち上げて、脳をすばやく取り除きます。メスで小脳を切り取ります。氷冷した切断液に脳を入れます。
- 内側前頭前皮質またはmPFC注射部位の場合:メスを使用して脳の前部(mPFCを含む)を切り取り、スライスするまで氷冷切断液に入れます。
- 濾紙で余分な切断液を取り除き、脳の後部をビブラートステージに接着します。
- 傾斜した扁桃体スライスの場合は、35°の角度でカットした寒天ブロック(4%)に脳を接着します(図1D、中央)。冠状扁桃体スライスの場合、内側膝状核/後層内視床核(MGm / PIN)注射部位およびmPFC注射部位は、脳をステージに直接接着します(図1D、左右)。スライス中の安定性のために、脳の後ろに追加の寒天ブロックを置きます。
- 冷却ユニットを使用して4°Cに維持される氷冷酸素化切断溶液でステージを切断チャンバーに入れます。サファイアブレードを使用して扁桃体(320μm)の鋭切片を準備します。スライスを、酸素化ACSFが供給される界面チャンバーに室温(RT)で入れます。
- 急性扁桃体スライスを調製した後、界面チャンバーを36°Cのウォーターバスに入れ、スライスを35〜45分間回収します。その後、インターフェースチャンバーをRTに戻します。
- ステップ1.10の開始時に、急性扁桃体スライス(ステップ1.8-1.9)について前述したように、注射部位のスライスを切断します。.ここでは、ウォーターバスでのスライスの回収は必要ありません。随意：注入部位の位置を迅速に推定するには、蛍光灯と適切なフィルターセットを備えたステレオスコープでスライスを観察します。
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結果
図1.定位注射、急性脳切片の調製、およびシナプス前線維の視覚化。(A、B)定位ウイルス注射。A) 頭蓋骨を露出させた状態で定位フレームに麻酔をかけたマウスと注射ピペットの写真。挿入図:ウイルス溶液とファストグリーンを混ぜた注入ピペットの写真を拡大します。スケールバー:3mm.(B)マウスの頭蓋骨の概略図で、さまざまな注入領域のドリル穴の位置がマークされています。(C)この研究で使用されたさまざまなウイルスコンストラクトを示すスキーム。ダークグレー:プロモーター配列;青:チャネルロドプシン2(ChR2(H134R));緑/赤:蛍光タンパク質。発現時間は、局所扁桃体投影で2週間、mPFCおよびMGm/PINからの投影で4〜6週間でした。(D)急性脳スライスの調製:異...
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 人工脳脊髄液(ACSF) | |||
| 内部パッチソリューション | |||
| 硫酸マグネシウム七水和物 | Roth, ドイツ | P027.1 | 精製水で2Mストック溶液を調製します |
| スライサー、マイクロムHM650V | フィッシャーサイエンティフィック、ドイツ | 920120 | |
| ティッシュスライサー用冷却ユニット CU65 | フィッシャーサイエンティフィック、ドイツ | 770180 | |
| サファイアブレード | デラウェアダイヤモンドナイフ | カスタムオーダー、会社に問い合わせる | |
| ステレオスコープ、SZX2-RFA16 | オリンパス(日本) | ||
| パッチマイクロスコープ BX51WI | オリンパス(日本) | ||
| バス温度調節器、TC05 | Luigs & Neumann, ドイツ | 200-100 500 0145 | |
| 界面チャンバー用硝酸セルロース濾紙 | Satorius Stedim Biotech、ドイツ | 13006 - 50 ACN |
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