マウス脳から扁桃体領域を露出させる冠状脳スライスの生成

Abstract

出典:Bosch, D., et al.脳スライスの恐怖回路のEx Vivo光遺伝学的解剖。J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオは、マウスの脳から薄い冠状脳スライスを調製し、内側前頭前皮質からのシナプス接続が豊富な扁桃体領域を露出させる方法を示しています。その後、スライスは酸素化された人工脳脊髄液に回収され、ニューロンの生存能力が維持されます。

Protocol

1. 急性スライスの調製

1. ACSF、切削液、工具(ハサミ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット)、寒天ブロックを準備します
   注: 1 回の実験で 1 L の人工脳脊髄液 (ACSF) が必要です。以前に発表したように、ACSFは、再蒸留したH2Oに化学物質を溶解することによって調製されます。切断液は、200 mLのACSFに0.87 mLの2 M MgSO₄ストック溶液を添加して調製します。
2. 実験全体を通してACSFと切断溶液を95%_O2および5%_CO2で酸素化します。
3. イソフルラン(3%酸素)を使用して、小動物麻酔器を使用してマウスに深く麻酔をかけます。続行する前に、手足の離脱反射を使用して麻酔の深さを確認してください。
4. 大きなハサミを使用してマウスの首を切り、すぐに氷冷した切断液で頭を冷やします。
5. 尾側から吻側への正中線を1回切開して頭蓋骨を開き、鉗子を使用して頭蓋骨の断片を側面にそっと押します。小さな丸いへらを使用して頭蓋骨から脳をそっと持ち上げることにより、脳をすばやく取り除きます。メスで小脳を切り取ります。脳を氷冷した切断液に入れます。
6. mPFC注入部位は、メスで脳の前部(mPFCを含む)を切り取り、スライスするまで氷冷した切断液に入れます。
7. 濾紙で余分な切断液を取り除き、脳の後部をビブラトームステージに接着します。
8. 冠状扁桃体スライス、MGm/PIN注入部位、およびmPFC注入部位の場合、脳をステージに直接接着します(図1D、左右)。スライス中の安定性のために、脳の後ろに追加の寒天ブロックを置きます。
9. 冷却ユニットを使用して4°Cに維持された氷冷酸素化切断溶液を備えた切断チャンバーにステージを置きます。サファイアの刃を使用して、扁桃体の冠状スライスを準備します。スライスを、酸素化ACSFが供給される界面チャンバーにRTで配置します。

Results

図 1.定位注射、急性脳切片の調製、シナプス前線維の可視化。(A、B)定位ウイルス注射。A) 頭蓋骨を露出させ、注射ピペットを装着した定位フレームに麻酔をかけたマウスの写真。挿入図:ウイルス溶液とファストグリーンを混ぜた注射ピペットの写真を拡大します。スケールバー:3mm.(B)マウスの頭蓋骨の概略図で、さまざまな注入領域のドリル穴の位置がマークされています。(C)この研究で使用されたさまざまなウイルスコンストラクトを示すスキーム。ダークグレー:プロモーター配列;青:チャネルロドプシン2(ChR2(H134R));緑/赤:蛍光タンパク質。発現時間は、局所扁桃体投影で2週間、mPFCおよびMGm/PINからの投影で4〜6週間でした。(D)急性脳スライスの調製:異な...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
人工脳脊髄液(ACSF)	構成については、参考文献#16および#23を参照してください
内部パッチソリューション	構成については、参考文献#16および#23を参照してください
スライサー、マイクロムHM650V	フィッシャーサイエンティフィック、ドイツ	920120
ティッシュスライサー用冷却ユニット CU65	フィッシャーサイエンティフィック、ドイツ	770180
サファイアブレード	デラウェアダイヤモンドナイフ
ステレオスコープ、SZX2-RFA16	オリンパス(日本)