海馬歯状回における非神経細胞から核を分離する技術

要約

出典:Kerloch, T., et al. Fluorescence-Activated Nuclei Negative Sorting of Neurons Combined with Single Nuclei RNA Sequencing to Study the Hippocampal Neurogenic Niche. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、マウス海馬歯状回(DG)のグリア細胞と幹細胞から無傷の核を単離する方法を示しています。DG組織は、冷ホモジナイゼーションバッファー中で機械的に解離し、核を放出します。組織破片やその他の放出されたオルガネラは廃棄され、核はDNA染色とニューロン核抗原(NeuN)に特異的な蛍光色素標識抗体で染色されます。次に、蛍光活性化核ソーティングを使用して、非ニューロン細胞のNeuN陰性核を単離します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています

1. DGの解剖 (タイミング:15分)

1. 核単離培地1および2(NIM1およびNIM2)、ホモジナイゼーションバッファー(HB)、および洗浄培地(WM)を調製します(表1)。必要になるまで、すべてのバッファー、培地、試薬、およびツールを氷上に置きます。Dounceホモジナイザー(材料の表を参照)を調製中(ホモジナイズステップの最低1時間前)に氷の上に置きます
   手記：NIM1は、4°Cで最大6ヶ月間調製および保存することができます。NIM2、HB、WMは新たに準備する必要があります.
   注意： ジチオスレイトール(DTT)、プロテアーゼ阻害剤、Triton X-100は慎重に操作してください。これらの化合物は、皮膚や目を刺激し、急性毒性があり、水生環境に危険です。これらの化学物質を使用する間は、保護手袋、衣服、目と顔の保護具を着用し、取り扱い後は手をよく洗い、環境への放出を避けてください。
2. 生後22ヶ月の雄C57Bl/6Jマウスを、Home Office Schedule 1の手順に従って頸部脱臼により安楽死させます。
   手記： この研究における生後22ヶ月齢マウスの使用に関する理論的根拠については、議論を参照してください。ただし、このプロトコルは、生涯を通じて任意の年齢で実行できます。
3. 安楽死させたマウスから脳を解剖し、氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた10cmのシャーレに移します(図1)。ペトリ皿を氷の上に置きます。メスを使用して小脳を切除し、両方の半球の間(矢状軸に沿って)脳を半分に切ります。
4. 新しい10cmのシャーレに氷冷したPBSを入れ、氷の上に置きます。脳の半分を新しいシャーレに移します。双眼鏡を使用してDGを解剖し、この手順を繰り返して、脳の後半から2番目のDGを取得します
   手記：これらのステップ (ステップ 1.2 から 1.4) は、前述の手順から適応されました。この段階では、細胞の完全性を維持するために、できるだけ早く進めることが重要です。
5. 2つのDGを予冷したDounceホモジナイザーに移し、1 mLの冷たいHBを加えます。

2. 組織解離、単一核単離、抗NeuN免疫染色 (タイミング:2時間)

1. 緩い「A」乳棒を10ストローク、続いてきつい「B」乳棒を15ストロークして組織を均質化します
   手記： デュース均質化は、摩擦と発泡によって引き起こされる熱を減らすために、氷上でモルタルを穏やかなストロークで実行する必要があります。すべてのバッファーと機器は、手順中に予冷し、氷上に保管する必要があります。
2. ホモジネートを予冷した 15 mL チューブに移し、Dounce ホモジナイザーを 1 mL の冷 HB ですすぎ、同じチューブに混ぜ合わせます。15 mLチューブに3 mLのHBを加え、氷上で5分間インキュベートします。チューブを軽く反転させて2倍に混ぜます。
3. 70 μmのストレーナキャップを0.5 mLのHBで50 mLの試験管にあらかじめ濡らします。ステップ2.2から、15 mLチューブを細胞ストレーナーに優しく傾けて、核懸濁液を濾します。セルストレーナーを0.5mLのHBで洗浄します。
4. セルストレーナーを取り外し、スイングバケット遠心分離機を使用して、試験管を500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨てます.
   手記：ホモジネートを濾すことで、フローサイトメトリーや一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)の下流ステップに重要なデブリを減らすことができます。
5. P1000ピペットを使用して、ペレットを4 mLのHBに穏やかに再懸濁します。氷上で5分間インキュベートします。500 x gで10分間、4°Cで遠心し、上清を捨て、ペレットを3 mLのWMに再懸濁します。
6. 15 mLの試験管に35 μmのストレーナーキャップを0.5 mLのWMで事前に濡らし、ステップ2.5から細胞ストレーナーを介して核懸濁液を濾し、P1000ピペットを使用して一度に0.5 mLを静かにピペッティングします。
7. ストレーナキャップを0.5mLのWMで洗い、チューブを氷の上に置きます。濾液を新しい15 mLチューブに移し、500 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。上清を捨て、ペレットを3mLのWMに再懸濁します。
上
8. 清を捨て、マウス抗ニューロン核抗原(NeuN)、AlexaFluor 488-標識抗体(抗NeuN-AF488、1:32,000)および1 μg/mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)と共にWM1 mLに再懸濁します。暗闇の中で氷の上で45分間インキュベートします.
   手記： 単離された核の免疫染色を最適化するには、抗体を滴定して、フローサイトメトリーの分析とソーティングに最適な希釈を決定することをお勧めします。次に、適切なコントロールを実行して、染色条件が最適であることを確認します。例えば、標識抗NeuN-AF488抗体を用いて、ネガティブコントロール(すなわち、抗体の添加なし、図2A)およびポジティブコントロール(すなわち、抗体による染色、図2B)を実行して、未染色集団と染色集団の分離を評価した。AF488標識抗体の使用を開始する場合は、特異性を評価するためにAF488標識アイソタイプコントロールを実行することをお勧めします。非標識抗体を使用する場合、二次抗体の非特異的結合を評価するために、二次抗体を核調製物のみに添加するなどの追加の制御が必要になることがあります。

3. ニューロン集団を除外するための蛍光活性化核選別(FANS)(タイミング:45分)

1. 免疫染色した核懸濁液を5 mLの試験管に移し、フローサイトメトリー手順の開始まで氷上に保ちます
   手記： 2匹のマウスDGよりも大きな組織片を扱う場合、溶液中の核密度が高くなった場合に蛍光活性化セルソーター(FACS)の詰まりを避けるために、WMバッファーでさらに希釈する必要があるかもしれません。
2. サンプルを低速で3秒間ボルテックスしてから、チューブをFACS装置に入れます(材料の表を参照).
   注:(FACSセットアップ)選別機は、手順の開始時にメーカーの推奨に従ってキャリブレーション粒子と位置合わせする必要があります。落下遅延は、FACSモデルに従ってビーズまたはマイクロスフェア(材料の表を参照)で較正されました。サンプルは、純度モードで4°Cで選別しました。収集量を減らすために、核を70 μmのノズルでフローサイトメーターの推奨圧力で選別しました。核は、50 μL の WM を含む 1.5 mL の低結合チューブ (材料表を参照) に選別しました。すべての採取チューブをPBS + 5%ウシ血清アルブミン(BSA)で4°Cで一晩コーティングし、チューブの壁に核が付着するリスクを軽減しました。
3. 染色した核懸濁液のサンプルからデータを取得するには、ゲートをDAPI高さとDAPI面積に設定して、細胞破片と凝集した核を除外します(図3A)。さらに、ゲートを対数側散乱光(SSC)領域と対数前方散乱光(FSC)領域に設定することにより、残りのDAPI染色凝集体または細胞破片から単一核を分離します(図3B)。
4. 図 3C に示すように、抗 NeuN-AF488 と FSC エリアのゲートを設定して、NeuN-AF488 陰性の集団を分離します。
5. 分析後、上記のゲーティング戦略を使用して、50 μL の WM.
   を充填した 1.5 mL コレクションチューブで NeuN-AF488 陰性集団を選別します 手記： 上記のゲーティング戦略と、成体マウスの脳からDGを単離する解剖手順に従うと、NeuN-AF488陰性の集団は、単一核の~14%を占めると予想されます。

>表1:研究で使用されたメディアとバッファの組成。

名 名 名 名 名 名 円 千株 名 名 名 円 の 円 円

核分離培地#1(NIM1)–4°Cで最大6か月保存
コンポーネント	容量 (μL)	最終濃度(mM)
1.5 M スクロース	1,833.30	250
1 M KCl	275	25
1 M MgCl2	55	5
1 M トリスバッファー、pH 8.0	110	10
ヌクレアーゼフリー水	8,726.70	-
総ボリューム	11,000	-
核分離培地#2(NIM2)–新鮮に作る
コンポーネント	容量 (μL)	最終濃度
NIM1	10,769	-
1 mM DTT	11	1 μM
100xプロテアーゼ阻害剤	110	1倍
トリトンX-100 10%(v / v)	110	0.1%(v/v)
総ボリューム	11,000	-
均質化バッファー(HB)–新鮮に
コンポーネント	容量 (μL)	最終濃度
NIM2	10,958.75	-
RNase阻害剤、40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasin、40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
総ボリューム	11,000	-
ウォッシュメディア(WM)
コンポーネント	容量 (μL)	最終濃度
BSAの7.5%	1,466.70	1%
RNase阻害剤、40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasin、40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
PBSの	9,492.05	-
総ボリューム	11,000	-

結果

図1:成体マウスの解剖されたDGからの非ニューロン集団のsnRNA-seqのための単一核懸濁液の調製。マウスDGの解剖、単一核懸濁液の調製、NeuN免疫染色、snRNA-seqに進む前のNeuN-FANSソーティング陰性など、プロトコールの主なステップを説明するフロー図です。

図2:FANSの免疫染色の検証。核懸濁液を、(A)ネガティブコントロールとして抗NeuN-AF 488抗体なしでインキュベートするか、または(B)抗体とインキ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5mlマイクロチューブ	エッペンドルフ	30124537
10.00μm Flouresbrite YGカルボン酸マイクロスフェア	ポリサイエンス	15700から10
15 mLポリプロピレン遠心チューブ	コーニング	430052
滅菌デュモン#5鉗子2組	ファインサイエンスツール	11252から30
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	シグマ・アルドリッチ	D9564-10MG
4150 TapeStationシステム	アジレント	該当なし
5 mL丸底高透明度ポリプロピレン試験管、スナップキャップ付き	隼	352063
5 mL丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き	隼	352235
50 mLポリプロピレン遠心チューブ	コーニング	430829
70 μmセルストレーナー	隼	352350
8ピークSPHEROレインボーキャリブレーション粒子	BDバイオサイエンス	RCP-30-5Aシリーズ
アキュドロップビーズ	BDバイオサイエンス	該当なし
アレグラX-30R遠心分離機	ベックマン・コールター	該当なし
抗NeuN抗体、クローンA60、Alexa Fluor 488	ミリポア	MAB377X
BD FACSアリアフュージョンフローサイトメーター	BDバイオサイエンス	該当なし
ベックマン・コールター MoFlo XDP	ベックマン・コールター	該当なし
BSAの7.5%	ギブコ	15260037
ジチオスレイトール(DTT)	サーモサイエンティフィック	R0861
デュースティッシュグラインダーセット:乳鉢、緩い乳棒(A)、タイトな乳棒(B)	キンブル	D8938-1セット
エッペンドルフチューブプロテインローバインド1.5ml	エッペンドルフ	30108116
Halt、100xプロテアーゼ阻害剤	サーモフィッシャー	78429
KClの	あらゆる化学品サプライヤー		実験室製
LUNA-FX7 自動セルカウンター	ロゴスバイオシステムズ	該当なし
MgCl2	あらゆる化学品サプライヤー		実験室製
N°10ガード付き滅菌使い捨てメス	スワン・モートン	6601
ヌクレアーゼフリー水	シグマ・アルドリッチ	W4502-1Lシリーズ
滅菌された学生用手術用ハサミのペア	ファインサイエンスツール	91401から12
PBSの	あらゆる化学品サプライヤー		実験室製
RNase阻害剤 40 U μl-1	アンビオン	AM2684
RNasin 40 U μl-1	プロメガ	N211Aの
滅菌ペトリ皿	コーニング	430167
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	59378から500G
トリスバッファー、pH 8.0	あらゆる化学品サプライヤー		実験室製
トリトンX-100 10%(v / v)	シグマ・アルドリッチ	T8787-250ミリリットル
トリパンブルー	インビトゲン	T10282

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