磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

要約

出典: Zhang, H. et al. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、磁気細胞ソーティングを使用してマウス脳の脱髄病変からミクログリア細胞を抽出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、ミクログリア細胞を含む病変のある脳組織を解剖し、特定の酵素で組織を処理して単一細胞懸濁液を取得し、ミクログリア受容体特異的磁気ビーズを利用してミクログリア細胞を単離することを含みます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 材料

1. プロトコルを開始する前に、次のソリューションを準備してください。
   1. ウシ胎児血清(FBS、2%)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に添加して、ローディングバッファーを調製します。
   2. 中性赤色(NR)色素(最終1%)をPBSに加えます。
2. 市販のAdult Brain Dissociation Kitを使用して、以下の溶液を調製します(材料の表を参照)。
   1. Enzyme Mix 1を調製するには、1.9 mLのBuffer Zと50 μLのEnzyme Pを15 mLの遠心チューブにピペット
   で移します。
   2. 酵素ミックス2を調製するには、20 μLのバッファーYと10 μLの酵素Aを1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで移します。
   3. デブリ除去液を準備します。

2. マウスの灌流と解剖

1. 腹腔内(i.p.)麻酔の2〜3時間前に、マウスにPBS中の500μLの1%NR色素を注入します
   手記：脱髄マウスモデルにおけるNRの腹腔内注射は、病変の識別に役立ちます(図1)。
2. ペントバルビタール(50 mg / kg、i.p.)でマウスに麻酔をかけ、痛みの反応を調べることにより、マウスがうまく麻酔されていることを確認します。
3. マウスの胸腔を開き、心臓を露出させます。
4. 右心房の小さな角を慎重に切り取り、左心室から20〜30mLの冷たいPBSをマウスに心内灌流します。
5. 麻酔下でマウスの首を切ります。
6. マウスの頭蓋骨を開き、脳を頭蓋骨から慎重に解放します。
7. マウスの脳スライス型に脳を移し、脳を0.1cmのスライスに切ります。
8. 脳のスライスを取り出し、ペトリ皿(60/15 mm)の冷たいPBSに入れます。顕微手術用鉗子を用いて、脳梁周辺のNR色素で標識された病変を実体顕微鏡で顕微鏡で解剖します
   手記：その後の移植を容易にするために、解剖された組織が可能な限り完全であることを確認してください。解剖の進行は2時間以内に完了する必要があります。
9. 解剖した組織を、適切な量のコールドローディングバッファーが入った15mLの遠心チューブに移します><。 手記：2〜3匹のマウスの脳梁組織を1つのサンプルとして1本のチューブにプールします。

3. 組織の解離

1. 解剖した組織を300 ×gで30秒間(この速度に達した後)遠心分離し、チューブの底でサンプルを採取します。
2. 酵素ミックス1と2をインキュベーターで37°Cに予熱します。
3. 予熱した酵素ミックス111を1つのサンプルに加え、インキュベーターで37°Cの5分間消化します。
4. 予熱した酵素ミックス230μLを加え、穏やかに混合します。
5. インキュベーターで37°Cで15分間消化し、5分ごとに穏やかに混合します。
6. 消化後、4mLの冷たいPBSをチューブに加え、穏やかに振とうします。
7. 70 μmのフィルターを50 mLの遠心分離チューブにセットし、フィルターを500 μLの冷たいPBSで予湿します。消化された組織サンプルをフィルターに通すことにより解離した組織をろ過し、50 mL遠心チューブ内のろ過された懸濁液を15 mL遠心チューブに移します< br /> 手記：ティッシュの量が少なすぎる場合は、この手順をスキップしてください。
8. ろ過した組織サンプルを300 ×gで4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引します
   手記：酵素消化を除くすべてのステップは氷上で実行する必要があります。

4. がれきの除去

1. 細胞ペレットを1,550 μLの冷PBSで穏やかに再懸濁します。
2. デブリ除去用の冷水450μLを加え、よく混ぜます。
3. 1,000 μLのピペットを使用して、2 x 1 mLの冷たいPBSで上記の混合物をゆっくりと穏やかに重ねます。
   手記： 遠心分離管を45°傾け、ピペットでチューブ壁に沿ってPBSをゆっくりと追加します。
4. チューブをゆっくりと穏やかに遠心分離機に移し、4°C、3,000 × gで10分間遠心します。
5. 遠心分離後の3つの層を探します。1,000 μLのピペットを使用して、2つの最上層を完全に吸引します(図2)。
6. チューブにコールドローディングバッファーを最大5mL充填し、チューブを3回静かに反転させます。
7. 4°C、1,000 × gで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引し、細胞ペレットを乱さないようにします。

>5. ミクログリア細胞の磁気的分離

1. 細胞ペレットを90 μLのローディングバッファーで再懸濁し、10 μLのCD11b(ミクログリア)ビーズを加えます。
2. よく混合し、4°Cで15分間インキュベートします。
3. ローディングバッファー1 mLを加え、1,000 μLピペットで液体を静かに上下にピペットで動かし、インキュベート後の細胞を洗浄します。細胞を4°Cおよび300 × gで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引して結合していないビーズを除去します。
4. 細胞を500 μLのローディングバッファーに再懸濁します。
5. MSカラムをセパレーターとともに配置し、磁場中で確実に選択します。
6. メーカーのプロトコルに従って、カラムを500 μLのローディングバッファーですすいで細胞を保護し、磁気ソーティングの効率を確保します。
7. 細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、標識されていない細胞を含むフロースルーを廃棄します。
8. 500 μL のローディングバッファーをカラムに 3 回加えて、カラム壁に付着した細胞を洗い流し、フロースルーを廃棄します><。 手記：洗浄用の新しいローディングバッファーを追加するのは、カラムリザーバーが空のときのみです。
9. カラムを洗浄した後、カラムをセパレーターから取り外し、15 mL の遠心チューブに置きます。
10. 1 mLのローディングバッファーをカラムに加え、プランジャーを底に押し込んで、磁気標識細胞を洗い流します。この手順を3回繰り返して、磁気的に標識された細胞を完全に収集します。

結果

図1:中性の赤色色素で標識された限局性脱髄病変の画像。

図2:遠心分離によって形成された3つの層の画像。上部の2つの層(レイヤー1 + レイヤー2)は、デブリ除去プロセスで除去する必要があります(プロトコルステップ4.5を参照)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心チューブ	バイオフィル	CFT001015
15 mL遠心分離チューブ	バイオフィル	CFT011150
50 mL遠心チューブ	バイオフィル	CFT011500
70μmフィルター	ミルテニーバイオテック	〒130-095-823
成体脳解離キット、マウスおよびラット	ミルテニーバイオテック	130-107-677
C57BL/6Jマウス	SJAラボ
CD11b(ミクログリア)ビーズ、ヒトおよびマウス	ミルテニーバイオテック	〒130-093-634
ウシ胎児血清	ボスター	PYG0001
MACSマルチスタンド	ミルテニーバイオテック	〒130-042-303
MiniMACSセパレーター	ミルテニーバイオテック	〒130-042-102
MS カラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-201
ニュートラルレッド	シグマ・アルドリッチ	1013690025
PBSの	ボスター	PYG0021
ペントバルビタール	シグマ・アルドリッチ	P-010
実体顕微鏡	ムシュオット	MZ62