動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 溶液の調製
- NGM-寒天プレート(1 L)
- NaCl 3 g、ペプトン培地 2.5 g(バクトペプトンなど)、寒天 20 g を加えます。オートクレーブ後、コレステロール 1 mL (95% エタノール [EtOH] ストックに 5 mg/mL)、1 mL の 1 M MgSO4、1 mL の 1 M CaCl2、25 mL の 1 M K2PO4、および 1 mL のアムホテリシン B (2.5 mg/mL ストック) を 1 mL 加えます。
- NGM-寒天 RNAi プレート (1 L)
- NaCl 3 g、ペプトン培地 2.5 g、寒天 20 g を加えます。オートクレーブ後、コレステロール1 mL(95%EtOHストック中5 mg/mL)、1 mLの1 M MgSO4、1 mLの1 M CaCl2、25 mLの1 M K2PO4、1 mLのアムホテリシンB(2.5 mg/mLストック)、1 mLの1 Mイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)、および1 mLのカルベニシリン(50 mg/mL)を添加します。
- ルリア-ベルターニ(LB)-寒天(1 L)
- ペプトン培地10 g、酵母抽出物5 g、NaCl 5 g、寒天20 g、1 M Tris pH 8.0 10 mL を添加します。H2Oを1 Lに加えます。オートクレーブ後、50 mg/mL カルベニシリン 1 mL と 5 mg/mL テトラサイクリン 2.5 mL を添加します。
- LBミディアム(1 L)
- ペプトン培地 10 g、酵母抽出物 5 g、NaCl 5 g、10 mL の 1 M Tris pH 8.0 を添加します。H2Oを1 Lに加えます。オートクレーブ後、50 mg/mL カルベニシリン 1 mL を添加します。
- M9バッファー(1 L)
- 6.0 gのNa2HPO4、3 gのK2PO4、5 gのNaCl、および50 mgのゼラチンを加えます。使用前に、1 mLの1 M MgSO4を加えてください。
- 漂白液(10mL)
- NaClO1 mLと5 N NaOH2 mLを添加します。H2Oを10 mLに加えます。
2. RNAiプレートの作製
>注:C. elegansは通常、7.5 mLの線虫増殖培地寒天培地(NGM-寒天)を含む6 cmのペトリプレートで実験室で培養されます。このプロトコルは、15°Cに保存されたワームに最適化されています。NGMを使用したプレートを調製するには、真菌や細菌の汚染を防ぐために標準的な滅菌技術を使用します。以下は、RNAi用の試薬を添加したNGMプレートを調製するためのプロトコールです。
- 1 mM IPTGと50 μg/mLのカルベニシリンを含む6 cm NGM-Agar RNAiプレートを調製します。暗所で室温で24〜48時間乾燥させます。
- RNAiプレートは暗所で4°Cに保ちます。14日以上経過した場合は使用しないでください。
- 50 μg/mL カルベニシリンと 12.5 μg/mL テトラサイクリンを含む LB 寒天プレート上の 3 相ストリーキングパターンを使用して、利用可能な RNAi ライブラリ 13 の凍結グリセロールストックから lin-53 遺伝子 DNA 配列を含む L4440 プラスミドを含む RNAi 細菌 (Escherichia coli HT115) クローンを選択します。バクテリアを37°Cで一晩増殖させます。このクローンは、細菌におけるlin-53 dsRNAのIPTG依存的な産生を可能にします。
- さらに、空のベクターコントロールとして、遺伝子配列を持たないL4440プラスミドを含むRNAi細菌を増殖させます。
- 翌日、200 μL のピペットチップを使用して lin-53 または空のベクター LB 寒天プレートから 1 つのコロニーを選択し、それぞれを 2 mL の液体 LB 培地と 50 μg/mL のカルベニシリンを添加した別々の培養チューブに接種します。600 nmで0.6 – 0.8の光学密度(OD)に達するまで、37°Cで一晩培養します。分光光度計を使用して外径を測定します.
注意:グリセロールストックから細菌をストリーキングするために使用されるLB寒天プレートとは対照的に、液体LB培地にはテトラサイクリンが含まれていてはなりません。
- マルチピペットを使用して、各細菌培養物(lin-53または空のベクター)を6 cm NGM-Agar RNAiプレートに500 μLを加えます。蓋を閉めた状態でプレートを室温で一晩、暗所でインキュベートして乾燥させます。この間、NGMプレートのIPTGは、細菌のdsRNAの産生を誘導します。
- 1回の実験につき、細菌培養ごとに少なくとも3枚のプレートを使用してください。これにより、各実験に対して 3 回のテクニカル リピートが提供されます。
- 乾燥させたNGM-寒天RNAiプレートをバクテリアと一緒に4°Cの暗所で最大2週間保存してください。
3. C. elegans BAT28株の調製
- 標準的なNGM-Agarプレートを使用して、OP50細菌に導入遺伝子otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)]およびntIs1 [gcy-5prom::gfp]を含む線虫株BAT288を15°C.
で維持します
注:線虫培養に関する詳細なプロトコールについては、以下を参照してください。rol-6(su1006)は、優性対立遺伝子であり、典型的なローリング運動を引き起こす一般的に使用される表現型注射マーカー16です。otIs305導入遺伝子でhsp-16.2prom::che-1を追跡するために使用されます。
- hsp-16.2prom::che-1導入遺伝子の慎重な活性化を防ぐために、BAT28株は常に15°Cに保ってください。ひずみをできるだけ扱いながら、15°Cを超える温度への暴露を減らしてください。
- ワームをエイジシンクロさせるには、漂白技術を使用します。
- 成虫とBAT28の卵が入った6 cm NGM-Agarプレートを900 μL M9バッファーで洗い流します。ワームを900 x gで1分間遠心分離してペレット化します。上清を取り除きます。
- 0.5〜1 mLの漂白液を加え、成虫が破裂し始めるまでチューブを約1分間振とうします。標準的な実体顕微鏡を使用してモニターします。
- 900 x gで1分間遠心分離してワームをペレット化し、上清を取り除きます。
- 800 μLのM9バッファーを加え、900 x gで遠心分離して、ワームペレットを3回洗浄します。
- 洗浄した卵を、OP50バクテリアを播種した新鮮なNGMプレートに置きます。OP50細菌の漂白集団を15°CでL4段階に達するまで増殖させます(約4日間)。L4幼虫は、標準的な実体顕微鏡を使用して、線虫18の腹側に沿って約半分の白い斑点によって認識できます
手記：lin-53が枯渇した際の生殖細胞からニューロンへの変換表現型を達成するためには、親世代(P0)で枯渇させる必要があります。変換表現型のスコアリングは、次の世代(親孝行世代F1)で行われます。すでにP0にある枯渇したlin-53を達成するために、L4動物にRNAiを投与する。
- 1回の複製につき50個のL4ステージワームを、白金線を使用して細菌を含まないNGMプレートに手動で移し、転写されたOP50細菌から線虫を遠ざけます。ワームをプレート上で約5分間動かします。以前にlin-53 RNAi細菌を播種したNGM-Agar RNAiプレートの細菌(またはエンプティベクターコントロール)を使用して、それぞれのRNAiプレートに移します。
- OP50 細菌を実際の RNAi プレートに移すことは避けてください。ひずみが15°Cを超える温度にさらされる時間を最小限に抑えるために、迅速に作業してください。
- NGM-Agar RNAiプレート上で、寄生虫のF1子孫がL3 – L4段階に達するまで、約7日間、寄生虫をインキュベートします。P0の動物はF1の子孫よりも大きくて厚いため、P0の動物とは明確に区別できます。
- 図1に示すように、F1子孫の線虫が突出した外陰部(pvul)の表現型を示すかどうかを標準的な実体顕微鏡で視覚的に確認します。lin-53に対するRNAiは多面発現効果を持ち、lin-53に対するRNAiが成功したかどうかを評価するために使用できるpvul表現型を引き起こします
手記： lin-53に対するRNAiもF1胚の致死性を引き起こす可能性があります。この効果は、動物がL3 – L4段階に到達する前にプレートが15°Cを超える温度にさらされると増加します。死んだ胚は、発生の停止と孵化の欠如によって認識できます。
- IPTGは光感受性であるため、暗闇でプレートをインキュベートします。
4. 生殖細胞のリプログラミングの誘導
- lin-53 と空のベクター RNAi 処理 F1 子孫を含む RNAi プレートを、暗所 37 °C で 30 分間インキュベートし、CHE-1 を活性化しました。ベント式インキュベーターを使用すると、より効率的なヒートショックが可能になります。
- 熱ショックを受けた動物を室温で30分間回復させ、その後、プレートを25°Cで暗所で一晩インキュベートします。
- 蛍光光源と組み合わせた標準的な実体顕微鏡を使用して、図2に示すように、線虫の中央部でgcy-5prom::gfp由来のシグナルについて、緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターの下で動物を調べます。GFPシグナル用の顕微鏡セット:励起最大488 nm、最大蛍光509 nm。
- 寒天パッド入り顕微鏡スライド上の中部にGFPシグナルを持つ動物をマウントすることにより、生殖細胞からニューロンへの変換の程度を評価します。
- 生殖細胞からニューロンへの変換を示す動物の数と暗い動物の数を数え、表現型の浸透度を評価します。典型的には、動物の約30%がlin-53の枯渇時に生殖系列に個別のGFPシグナルを示すのに対し、空のベクターRNAiの生殖細胞系に拡散性GFPシグナルを示すのは5%以下である。
