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>免責事項:サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 脳と脊髄の機械的均質化
>注:このセクションで説明するボリュームは、脳または脊髄の半分の均質化に十分です。
- 氷の上に置かれたDounceティッシュグラインダー(Table of Materials)のガラスモルタルを事前に冷やします。
- 3 mLの事前に冷却した1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)を乳鉢に加えます。
- 組織(脳または脊髄)を6ウェルプレートのウェルからガラスモルタルに移し、1x HBSSに浸してモルタルの底にあることを確認します。
- 10ストロークの乳棒Aと続いて10ストロークの乳棒Bで組織を穏やかに粉砕し、均質化された混合物を新しい15mLの円錐管に移します。
- 予冷した1x HBSSを使用してチューブを最終容量10 mLまで充填し、320 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、氷冷した1x HBSSを各チューブに最終容量7 mLまで加え、ボルテックスしてペレットを穏やかに再懸濁します。
2. デブリの除去
>注:主に未消化の組織とミエリン鞘で構成される破片の除去は、その後のフローサイトメトリー分析のために組織ホモジネートを効率的に染色するための重要なステップです。
- 各サンプルを70 μmのセルストレーナーでろ過し、未消化の組織チャンクを除去します。このステップは、脊髄組織を扱う場合に特に重要であり、これらのサンプルには未消化の神経片や髄膜が含まれている可能性が高く、その後のステップに影響を与える可能性があります。
- 各サンプルチューブの最終容量が7 mLであることを確認してください。そうでない場合は、氷冷した1x HBSSを最大7mLまで充填します。
- 各サンプルに 3 mL の予冷済み等張性 Percoll 溶液(IPS)を加えて、最終濃度 30% の密度勾配培地を含む溶液 10 mL の最終容量を作ります。サンプルを穏やかにボルテックスして、均一に混合されていることを確認します。
- 700 x g、18°Cで15分間サンプルを遠心分離し、遠心分離機の加速度を7に、ブレーキを0.
に設定します。
手記： 遠心分離には約30分かかります。
- 遠心分離機からサンプルを繊細に取り出します.
手記：破片とミエリンで構成された白っぽい円盤が溶液の表面に浮かんでいるのが見えるはずです。ペレット(目的の細胞を含む)がチューブの底に見えるはずです。
- 破片の白っぽい円盤をすべて慎重に吸引し、次に残りの上清を吸引し、ペレットが外れないようにします。細胞ペレットの上に約100μLの溶液を残して、誤って細胞ペレットが外れてしまうリスクを避けてください。
- 1 mLのフローサイトメトリー(FACS)ブロッキング(BL)溶液を加え、1000 μLのピペットチップでピペッティングを上下させてペレットを再懸濁し、サンプルを1.5 mLのチューブに移します。
- 室温(RT)で450 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を穏やかに吸引し、ペレットを下流の分析に適したバッファーに再懸濁
します