$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 材料の準備
- 磁気活性化セルソーティング(MACS)バッファー:2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)(材料表)をPBS-/-で調製します。
- コラゲナーゼIVストック溶液(20 U/μL):粉末をPBS+/+(Table of Materials)に再懸濁し、分注し、-20°Cで保存します
手記：コラゲナーゼIVでは、MgCl2が完全に活性化する必要があります。コラゲナーゼIV溶液を凍結融解しないでください。.
- 麻酔鎮痛液:ケタミン150μL(150mg/kg)、キシラジン25μL(5mg/kg)、ブプレケア330μl(0.1mg/kg)をPBS-/-.
1mLに混ぜます。
手記：麻酔薬 - 鎮痛剤溶液を即席で調製し、それを1日以上保持しないでください。
- ヘパリン溶液(100 U / mL):粉末をPBS-/-に再懸濁します。.
- PBS-/-で満たされたデカンタErlenmeyerにチューブを接続する注入インセットシステムを準備します。23Gの針を輸液チューブの先端に接続します。インフュージョンインセットを開き、チューブ内に気泡がなくなるまでPBSを作動させます。
- ライト付きの双眼ルーペを用意します。
2. C57BL/6マウスの飼育
- CP(脈絡叢)骨髄細胞またはT細胞の解析には、それぞれ4匹のマウスを使用し、4つのCP(各側脳室から2匹、第3心室、第4心室CPから2匹、合計8匹のマウス)をプールします。CPをプールしないと、CPの希少な免疫集団の存在量が少ないため、検出できないリスクがあります。
- 実験の前に、マウスを少なくとも7日間順応させます。マウスを一定の温度と湿度で病原体のない条件下で、12/12時間または14/10時間の明暗サイクルで、水と標準的なペレット食品を自由に使用してください。
>3. PBS灌流と脳解剖
- 各マウスの重量を量り、10 μL/gの麻酔薬-鎮痛剤ミックス溶液(ステップ1.3)を腹腔内に注入します。
- 効率的な鎮痛のために約30分待ちます(マウスの指をつまんで麻酔の深さを確認してください)。
- 麻酔をかけたマウスを仰向けに平らに置き、解剖サポートに手のひらをテープで固定します。
- 動物の皮膚を鉗子でつまんだり、ハサミを使ったりして、腹部、横隔膜、胸部を開き、心臓を露出させます
手記：胸部が開くと、脳は無酸素状態になります。灌流の次のステップを正確かつ迅速に進める必要があります。
- 20 μL の 100 U/mL ヘパリン溶液を左心室に直接注入します。
- 細いハサミで、血液が体外に流れ出るように、右心房に少なくとも3mmの切開をします。
- 直後に、注入チューブの先端に配置された23Gの針を左心室の先端から挿入します。
- 輸液システムを最大限に開き、完全な灌流を待ちます:23Gの針を約6mL/minの流速で使用することで、灌流は3分で完了します
手記：肝臓などの臓器の均一な変色は、灌流効果を証明しています。
- 輸液システムを閉じ、心臓室から針を取り外します。
- マウスの手のひらからテープをはがします。マウスを腹側の位置に置きます。
- 鉗子で動物の皮膚をつまみ、はさみを使用して、頭のてっぺんから目から耳まで皮膚を取り除きます。
- はさみの助けを借りて、最初に目の間に頭蓋骨を切り、次に各目から咬筋のすぐ上の脊髄まで横方向に切ります。このためには、ハサミの先端を使用し、ハサミで脳に損傷を与えないように穏やかに進みます。
- 鉗子で頭蓋骨を目の間の端からつまんで開きます。
- ハサミを使って脊髄を切断し、鉗子で脳を摘出し、脳の外側に2つの点を置いて傾け、氷のように冷たいPBS+/+で満たされたペトリ皿に入れます。その後、CP はすぐに収集されます。
手記：脳の変色がないか確認し、灌流効果を確認します。
4. 脳からの脈絡叢の解剖
- 脳の背側を上にしてペトリ皿に置き、双眼ルーペの対物レンズの下に配置します。
- 脳を所定の位置に維持するために鉗子の助けを借りて、別の鉗子の両端を半球間の正中線を通して挿入します。
- 鉗子を使用して、脳梁と海馬のある皮質を中隔から引き離し、側脳室と第3脳室の一部を露出させます。
- 外側CPは、両端でフレアしている側脳室を覆う長いベールとして識別します。細い鉗子の両端を使用して、外側のCPをキャッチします海馬の後部に隠れている可能性のある三角形の後部を集めるように注意してください。
- 反対側の半球の皮質、脳梁、海馬を中隔から引き離して、第3脳室全体と反対側の側脳室を露出させます。
- 細かい鉗子で3番目のCPを収集しますが、これは粒状の表面の側面を持つ短い構造として識別できます。
- 他の横方向の CP を収集します。
- 鉗子の両端を小脳と中脳の間に挿入します。小脳を橋と髄質から切り離して、第4脳室を露出させます。
- 第4CPは、小脳と髄質の間の外側の右端から左端まで第4脳室を覆う粒状の表面側面を持つ長い球状構造として識別します。細い鉗子で4番目のCPを集めます.
手記：鉗子のシランベースコーティングは、鉗子のCPのべたつきを防ぐ可能性があります。
- 他の7匹のマウスそれぞれについて、手順3.1〜4.9を繰り返します。その間、収集されたCPは、氷の上に置かれたチューブに一時的に保持することができます。
5. フローサイトメトリー解析用サンプルの調製
- すべての切片CPを含むチューブを750μLのPBS+/+.
に充填します。
手記：チューブ内の細い鉗子で解剖されたCPを沈着させると、少量のPBS+/+が生成されます。CP組織の損失を避けるためには、既存の容量を取り外して新しい750μLのPBS+/+と交換するよりも、既存の容量を750μLに完成させる方がよいでしょう。
- 20 U/μL Collagenase IVストック溶液15 μL(ステップ1.2を参照)を15 μL加え、最終濃度400 U/mL
手記：DNAse I(150 μg/mL)は、細胞の過剰な凝集を防ぐ可能性があります。
- CPとコラゲナーゼIVを37°Cで、軽度の撹拌(300 RPM)で45分間インキュベー
トします。
- CPの解離を完了するために、約10回静かにピペットで上下させます。
- CPチューブにMACSバッファー(レシピステップ1.1を参照)を1.5 mL充填し、コラゲナーゼIVの活性を停止します
手記：コラゲナーゼIVの活性は低温で停止し、血清アルブミンによって阻害されます。
- 細胞を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、1.5 mLのMACSバッファーで細胞を洗浄します。
- 細胞を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てて細胞を220 μLのMACSバッファーに再懸濁します。