ヒト人工多能性幹細胞のミクログリア様細胞への分化

要約

出典:Funes, S. et al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-Cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes.J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、ヒト多能性細胞がミクログリア様細胞に分化する手順を示しています。このプロセスには、胚様体を形成し、それらをコーティングされたウェルに移し、特定の成長因子を使用して原始的なマクロファージ前駆体への分化を誘導し、最終的にミクログリア様細胞に分化することが含まれます。

プロトコル

1. ミクログリアの分化

>注:プロトコルの概要を図1にまとめます。

1. 人工多能性幹細胞(iPSC)培養
   手記：iPSC培養技術の詳細については、他の場所でご覧いただけます。
   1. 解凍とメンテナンス
      1. iPSC培地を調製して分注し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。アリコートを4°Cで一晩解凍し、最大1週間使用します。メディアを周囲温度で少なくとも1時間放置してから使用してください。
      2. カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈したラミニン521の10 μg/mLを1 mL加えて、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で少なくとも2時間、できれば一晩保管します。希釈したら、ラミニンを4°Cで3ヶ月間保存します。
      3. 10 mM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632(ROCK阻害剤)原液を滅菌水で希釈して調製します。ROCK阻害剤溶液のシングルユースアリコートを作成し、-20°Cで最大1年間保存します。
      4. 0.5 M EDTAのストック溶液をDPBSで希釈することにより、0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を調製します。
      5. 凍結したiPS細胞のバイアルを解凍するには、バイアルを37°Cの水浴に置き、ほとんど解凍します。バイアルの内容物を、4 mLのiPSC培地が入った15 mLのコニカルチューブに直ちに移します。500 × gで1分間遠心分離します。
      6. 上清を吸引し、コロニーを乱さないように、10 μM ROCK阻害剤を含むiPSC培地1 mLをチューブの壁にゆっくりと加えて細胞を再懸濁します。
      7. 10 μM ROCK阻害剤を含む1.5 mLのiPSC培地をコーティングされた各ウェルに加え、再懸濁したコロニーを培地を含むウェルに一滴ずつ移します
         手記：培養維持にはステップ1.1.1.6の5〜7滴を使用しますが、iPS細胞ラインごとに最適な播種密度を調整してください。
      8. プレートを左右および前後に手動でシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分散させます。細胞を37°C、5%CO₂のインキュベーターに入れます。翌日、ROCK阻害剤を含まない新しいiPSC培地を追加して、培地を完全に交換します。
      9. メンテナンスのために、細胞が80%の密度に達するまで毎日培地を交換してください。
         手記：使用するiPS細胞培地が柔軟な供給スケジュールを可能にする場合、細胞は培地を2日間交換せずに維持できます。これを継代ごとに1回に制限し、細胞のコンフルエントが50%未満の場合にのみ行うことをお勧めします。
   2. 分割
      1. 培地を吸引し、1 mLのDPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)で細胞を洗浄します。
      2. 細胞を取り除くには、0.5 mM EDTAを1 mL加え、細胞コロニーの端がウェルの表面から浮き上がるまで室温で2〜3分間インキュベートします。再度細胞をDPBSで洗浄し、iPSC培地1mLを加えます。
      3. 細胞コロニーをセルリフターを使用して優しくこすり落とすことにより、細胞コロニーを解離します。コロニーの邪魔にならないように、井戸の各領域を一度だけこすり落とします.
         手記：コロニーを井戸から取り除く別の方法は、他の場所で見つけることができます。
      4. 1 mLのピペットチップを使用して細胞を回収し、1.5 mLのiPS細胞培地を含むプレコートウェル(ステップ1.1.1.2で述べたように)に1:6の比率(細胞と培地)で一滴ずつ移します。

2. iPS細胞のミクログリア様細胞(iMG)への分化

>注:低分子と成長因子は、DPBS中の滅菌ろ過された0.1%ウシ血清アルブミンに最終濃度の1,000倍高いストック濃度に溶解されます。iPS細胞は、早期の継代時にiMGに分化することが推奨されます。iPSC株の定期的な核型分析が推奨されます。

1. 標準コーティング液を調製します
   1. 細胞外マトリックスコーティング試薬のストック溶液を氷上で4°Cで一晩解凍します。
   2. 微量遠心チューブとフィルターピペットチップを4°Cで予冷します。
   3. 濃縮された細胞外マトリックスコーティング試薬250μLを各チューブに分注し、すぐに氷上に置きます。アリコートは-20°Cで保存します。
   4. コーティング溶液を調製するには、細胞外マトリックスコーティング試薬アリコートの1つを氷上で4°Cで一晩解凍します。
   5. ヒト胚性および人工多能性幹細胞(DMEM-F12と呼ばれる)培地の増殖に最適化された氷冷したダルベッコの改良型イーグル培地/栄養混合物F12(DMEM-F12)50 mLを予め冷却した円錐管に加え、氷上に保ちます。
   6. 氷冷したDMEM-F12を複数回上下にピペッティングして1 mLのピペットチップを冷却し、すぐにピペットチップを使用して250 μLの細胞外マトリックスコーティング試薬をDMEM-F12培地の入った円錐管に移します><。 手記：標準コーティング液は、4°Cで2週間保存できます。
2. 胚様体(EB)形成
   1. 4°Cで最大4日間維持できるEB培地を準備します。
   2. iPS細胞が80%のコンフルエント度に達したら、1 mLのDPBSで洗浄し、1 mLの解離試薬を1 mLの解離試薬を37°Cで2分間加えてコロニーを解離します。セルリフターで複数回こすり落とし、シングルセル懸濁液を作成します。細胞を採取し、9mLのDPBSが入った15mLのコニカルチューブにすべてを移します。
   3. 細胞を500 × gで1分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1 mLのEB培地に再懸濁します。10 μLの細胞を取り出し、トリパンブルーで1:1に希釈します。血球計算盤で細胞をカウントし、細胞数に基づいて、細胞ストックを100 μLあたり10,000細胞の最終希釈に希釈します。細胞をめっきするには、希釈した細胞をウェルあたり100 μLを低接着の丸底96ウェルプレートに加えます。
      手記：一般に、96ウェルプレートの48ウェルは、iPS細胞の80%コンフルエントウェルから得ることができます。
   4. プレートを125 × gで3分間遠心分離し、37°Cおよび5%CO₂で4日間インキュベートします。2日目にマルチチャンネルピペットを使用して50 μLの古い培地を静かに回収し、50 μLの新鮮なEB培地を再び加えて、半培地の交換を行います。
      手記：4日目には、iPS細胞は、結果セクションで説明したように、EBと呼ばれる球状の細胞構造を形成します。EBの分化プロセスは、必要に応じて最大7日間延長できます。
3. プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)の生成
   1. PMPベース培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存します。
   2. 1 mLの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて6ウェルプレートのウェルをコーティングし、37°Cおよび5%CO₂で少なくとも2時間、できれば一晩インキュベートします。
   3. EB分化の4日目に、1 mLピペットチップでEBを収集して(ピペットを使用して)、EBをMatrigelコーティングウェルに移します。ピペットを1回または2回上下させて、EBをウェルから取り除きます。EBがウェルの端に落ち着くように、6ウェルプレートを傾けた角度で保持します。
      手記：コーティングされたウェルごとに9個または10個のEBをめっきできます。
   4. すべてのEBが落ち着いたら、EBをウェルの端に保ちながら、1 mLのピペットチップを使用して古い培地を静かにピペットで取り出します。調製したばかりのPMP完全培地3 mLを各ウェルに加えます。プレートを左右および前後に手動でシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分散させます。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で置きます。
   5. EBがウェルの底に付着するのを防ぐために、プレートを7日間邪魔しないでください。その後、PMP complete medium を使用してハーフ ミディアム チェンジを実行します。
      手記：この時点で、ほとんどのEBをプレートに取り付ける必要があります。フローティングEBは削除できます。
   6. 5〜7日後、EBを4倍の倍率でライトフィールド顕微鏡で検査し、EBがウェルの底に付着していることを確認します。1.2.3.5の説明に従ってメディアを変更します。21日目に、3 mLのPMP完全培地で培地を完全に交換します
      手記：この時点で、培地に浮遊する骨髄系前駆細胞が明らかになる可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります。
   7. 28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探し、10 mLピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を回収します。EBを乱さないように注意してください。PMPと培地を15 mLのコニカルチューブに移し、ステップ1.2.4.
      の説明に従って進めます。 手記：通常、同じiPS細胞株のPMPは、6ウェルプレートの5つのウェルから採取し、1本の15 mLコニカルチューブにプールすることができます。
   8. EBのさらなるメンテナンスのために、3 mLの新鮮なPMP完全培地を追加します。PMPはEBから3か月以上連続して出現するため、手順1.2.3.7および1.2.3.8.
      で説明されているように、4〜7日ごとに収集します(媒体の色が黄色の色調に変わるのを許さないでください) 手記：PMPは数ヶ月間採取することができますが、時間の経過とともに表現型が変わることがあります。
4. iMGとの差別化
   1. iMGベース培地(材料表)を調製し、滅菌フィルターで4°Cで最大3週間保存します。
   2. PMPを15mLのコニカルチューブに集めたら、200 × gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、1〜2 mLのiMG基礎培地を使用してPMPを再懸濁します。血球計算盤を使用して、少量のアリコートを取り、トリパンブルーで1:1に希釈することにより、細胞をカウントします.
      注:0.5〜1.5 × 10⁶ PMPは、iPSC系統とEB培養の年齢に応じて、通常毎週取得されます。
   3. 残りの細胞を再び200 × gで4分間遠心分離し、新たに調製したiMG完全培地を使用して、細胞培養処理済みプレート上に細胞が~10⁵/cm²の密度でプレーティングされるように、PMPを所望の濃度に希釈します。新たに調製したiMG完全培地を使用して、10〜12日間にわたって3〜4日ごとに半培地交換を行い、最終分化を可能にします
      手記：この時点で、細胞はミクログリア様の形態を獲得するはずです。ミクログリアの運命に対するPMPの関与を確認するために、免疫蛍光分析を行い、プリン作動性受容体P2RY12や膜貫通タンパク質119などのミクログリアが豊富なマーカーの発現を裏付けます(TMEM119)。
   4. 細胞の健康と生存率を維持するために、iMG分化の10日目から12日目の間にすべての実験を実施します。

結果

図1:iPS細胞をミクログリア様細胞に分化するためのプロトコルの概略図。0日目に、iPS細胞が80%のコンフルエント度に達すると、コロニーを単一細胞に解離し、EB培地で培養してEB形成を誘導します。4日目に、EBを採取し、PMP培地に播種してPMP生成を誘導します。28日後、PMPを採取し、iMG培地を用いて末端的にiMGに分化させます。PMPは、最大3か月間、毎週収集できます。略語:iPSCs =人工多能性幹細胞;iMGs = ミクログリア様細胞;EB = 胚様体;PMP = プリミティブマクロファージ前駆体。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養材料
6ウェルプレート	グライナーバイオワン	657160
100 mm x 20 mm 組織培養処理済み	セルトリート	229620
セルリフター、ダブルエンド、フラットブレード&ナローブレード、滅菌済み	セルトリート	229305
低密着性丸底96ウェルプレート	コーニング	7007
Primaria 24ウェル平底表面改変マルチウェル細胞培養プレート	コーニング	353847、
Primaria 6ウェルセルクリアフラットボトム表面改質マルチウェル培養プレート	コーニング	353846
Primaria 96 ウェル クリア フラット ボトム マイクロプレート	コーニング	353872
細胞解離試薬
アキュターゼ	コーニング	25058CIの	低運動ニューロンの分化に使用される解離試薬
TrypLE試薬	ライフテクノロジー	12-605-010	ミクログリアの分化に用いる解離試薬
UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0	インビトゲン	15575020
細胞培養用コーティング試薬
マトリゲルGFRメンブレンマトリックス	コーニング™	354230	細胞外マトリックスコーティング試薬と呼ばれる
CellStickラミニン-521	STEMCELLテクノロジー	77004	ラミニン521と呼ばれる
ポリ-D-リジン	シグマ	P7405	ホウ酸緩衝液中で0.1 mg/mLに再構成
ポリ-L-オルニチン	シグマ	P3655	ホウ酸緩衝液中で1 mg/mLに再構成
iPSCメディアのコンポーネント
mTeSR Plusキット	STEMCELLテクノロジー	〒100-0276	iPSC培地を調製するには、コンポーネントを1xに混合します
EBメディアのコンポーネント
BMP-4	フィッシャーサイエンティフィック	PHC9534	最終濃度 50 ng/mL
iPSC メディア			最終濃度 1x
ROCK阻害剤Y27632	フィッシャーサイエンティフィック	BD 562822	最終濃度 10 μM
SCFの	ペプロテック	300から07	最終濃度 20 ng/mL
ベグフ	ペプロテック	100-20A	最終濃度 50 ng/mL
PMPベースメディアのコンポーネント
グルタマックス	ギブコ	35050061	最終濃度 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15140122	最終濃度 100 U/mL
X-VIVO 15	ロンザ	12001-988	最終濃度 1x
PMPコンプリートメディアのコンポーネント
55 mM 2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023	最終濃度 55 μM
IL-3	ペプロテック	200から03	最終濃度 25 ng/mL
M-CSFの	ペプロテック	300〜25	最終濃度 100 ng/mL
PMPベースメディア			最終濃度 1x
iMGベースメディアのコンポーネント
アドバンスドDMEM/F12	ギブコ	12634010	最終濃度 1x
グルタマックス	ギブコ	35050061	最終濃度 1x
N2サプリメント、100倍	ギブコ	17502-048	最終濃度 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15140122	最終濃度 100 U/mL
iMGコンプリートメディアのコンポーネント
55 mM 2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023	最終濃度 55 μM
IL-34	PeproTechまたはBiologend	200-34 または 577904	最終濃度 100 ng/mL
iMGベースメディア			最終濃度 1x
M-CSFの	ペプロテック	300〜25	最終濃度 5 ng/mL
TGF-β	ペプロテック	100-21	最終濃度 50 ng/mL
インダクションベースメディアのコンポーネント
DMEM/F12 HEPES搭載	ギブコ	11330032	最終濃度 1x
グルタマックス	ギブコ	35050061	最終濃度 1x
N2サプリメント、100倍	ギブコ	17502-048	最終濃度 1x
非必須アミノ酸(NEAA)、100x	ギブコ	11140050	最終濃度 1x
完全な誘導媒体のコンポーネント
コンパウンドE	カルバイオケム	565790	最終濃度0.2 μM、ストック試薬を1:1エタノールおよびDMSO中で2 mMに再構成
ドキシサイクリン	シグマ	D9891	最終濃度を 2 μg/mL にし、ストック試薬を DPBS 中で 2 mg/mL に再構成します
インダクションベースメディア			最終濃度 1x
ROCK阻害剤Y27632	フィッシャーサイエンティフィック	BD 562822	最終濃度 10 μM
その他の細胞培養試薬
トリパンブルー、0.4%溶液	アムレスコ(株)	K940-100ミリリットル
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	22144-77-0
カルシウムとマグネシウムを含むDPBS	コーニング	21-030-CV
カルシウムとマグネシウムを含まないDPBS	コーニング	21-031-履歴書	DPBSと呼ばれる
ノックアウトDMEM/F-12	ギブコ	12660012	DMEM-F12は、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の増殖に最適化
ラミニンマウスタンパク質、天然	ギブコ	23017015	ラミニンと呼ばれる