マウス網膜から得られたMüllerグリア細胞培養の確立

要約

出典:Kang, S., et al. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、マウスの網膜から単離されたミュラーグリア(MG)細胞の培養を示しています。網膜は、消化酵素を使用して単一細胞懸濁液に解離されます。次に、MG細胞の増殖とニューロン細胞の死滅を促進する成長因子を持つ培地で細胞を増殖させます。死んだ神経細胞は継代中に除去され、MG細胞はさらなる分析のために増殖されます。

プロトコル

>免責事項:サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 網膜の解離

>注:以下のすべてのステップ(細胞採取まで)は、A2またはB2バイオセーフティキャビネット(BSC)で実行する必要があります。

1. パパイン/DNase I 解離混合物を次のように調製します。
   1. 6つの網膜の場合、750μLのパパインが入ったチューブに75μLのDNase Iを加え、慎重に混合します(解離混合物)。
   2. このプロトコールに必要な個々のサンプル調製では、総容量825 μLを3つのアリコートに分割します:マウス1本あたり1.5 mLチューブ(2つの網膜)に混合物275 μLを充填します。それに応じて、DNase IとPapainの必要量を計算します
      手記：パパイン/DNase I混合物の1本のチューブで最大6つの網膜を解離できます。ただし、個々のサンプル調製では、組み合わせたサンプルよりも凝集が少なく、細胞増殖が良好になります。
2. 2つの網膜をPapain/DNase I解離混合物に移します。先端径を大きくしたトランスファーピペットを使用し、網膜を拾い上げ、網膜が先端の下部に落ち着くまで待ってから、過度にハンクス平衡塩溶液(HBSS)をせずに網膜をパパイン/ DNase I混合物を含むチューブに放出します。.
3. ニューテーターに置き、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)で10分間インキュベー
トします。
4. 1mLのピペットで慎重に上下(約20〜30回)して細胞を解離します。細胞が解離した後(すなわち、チャンクのない均質な溶液が得られる)、Papain Dissociation Kitから275 μLのOvomucoidプロテアーゼ阻害剤を添加して、パパインを中和します。ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。注:6つの網膜が825μLのパパイン/ DNase I混合物で解離した場合、825μLのオボムコイドが必要です。.
5. 混合物を300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
6. 37 °Cで予熱した成長培地の計算容量(マウスあたり1 mL)に上皮成長因子(EGF、成長培地1 mLあたり1 μL、PBSで200 μg/mLに再溶解)を添加します>< 注:実験デザインに応じて、増殖マーカーの5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)、またはその他の必要な因子を培養期間の開始時に追加できます。
7. チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。チューブの底にあるペレットには触れないでください。
8. 上澄みを慎重かつ完全に取り除きます。細胞ペレットを500 μLのEGF添加増殖培地で再懸濁します。
9. 細胞懸濁液を標識された12ウェルプレートの1つのウェルに移します(図1C)。EGFを添加した増殖培地をさらに500 μLでチューブをすすぎ、ウェルに加えます(ウェルあたり総容量1 mL)。
10. 他のすべてのサンプルで手順1.8と1.9を繰り返します。
11. ウェルプレートを3回慎重に(前後、左、右)揺らします。プレートをインキュベーター(37°C、CO₂)に入れます
    手記：トランスジェニックマウスを使用する場合は、すべての動物に対してジェノタイピングを実施します(図1D)。Creリコンビナーゼ陽性マウスと陰性マウスを同定し、それに応じてプレートを標識します。このプロトコルでは、Creリコンビナーゼ陽性レポーターマウスの細胞のみを次のステップに使用しました。Cre陰性検体の細胞は凍結され、他の用途に使用されます。

2. 成長フェーズ

>注:成長期の期間は約4〜5日です(図2B)。細胞を含むウェルに液体を添加するには、ピペットをウェルの壁に向け、細胞の剥離を避けるために液体をゆっくりと放出する必要があります。セルの上に直接ピペットで移さないでください。

1. 解離の1日後、培地を取り出し、新鮮なEGFを添加した増殖培地1mLを追加します。
2. 3日目に培地を取り出し、HBSS(室温)1mLを加えて細胞破片を取り除きます。左から右に緩やかに前後に揺らします。HBSSを取り出し、洗浄ステップを繰り返し、予熱したEGF添加増殖培地1 mLを加えます。
3. 細胞を毎日監視し、細胞が90%〜100%の密度に達するまで細胞の成長状態を評価します。図3は、MGの経時的な良好な成長の例を示しています。汚染や細胞死の可能性がないか確認します。汚染された培養物を廃棄する.
   手記：細胞の状態をモニターおよび記録するには、カメラを取り付けた光学顕微鏡と4倍、10倍、または20倍の対物レンズを使用して、さまざまな倍率で画像を撮影します。この研究では、蛍光顕微鏡を使用します。

3. ポリ-L-オルニチン(Poly-O)とラミニンコートを用いたカバースリップの作製

>注:この手順は、免疫蛍光標識および共焦点レーザー走査型顕微鏡法を実行する場合にのみ必要です。適切なイメージングには、丸いガラスカバースリップ(直径12 mm)が必要です。コーティングプロトコルは、ニューロン媒体のデータシート(材料の表を参照)にも記載されています。

1. 滅菌デュモン #2AP 鉗子を使用して、24ウェルプレートの各ウェルの中央に滅菌カバースリップを慎重に配置します
   手記：ウェルの中央にカバースリップを置きます。ウェルの壁の近くにカバースリップを配置すると、次の手順で表面張力の問題が発生します。
2. 2.5 mL Poly-O アリコートを室温で解凍し、100 μL を各カバースリップの中央に置きます。
3. ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。
4. Poly-Oを取り外し、カバーガラスでウェルを~1mLの滅菌水で3回洗浄します。
5. ウェルプレートをBSCで一晩乾かします。2.5 mLのラミニンを4°Cで一晩解凍します。
6. 翌朝、各カバーガラスの中央に100 μLのラミニンを加え、37 °Cのインキュベーターで4時間インキュベートします。
7. ラミニンを慎重かつ完全に取り外します。
8. 継代がすぐにできない場合は、プレートを4°Cに保ちます.
   手記：準備されたプレートにコーティングされたカバースリップは、4°Cで数日間保管できます。

>4. 細胞継代による神経細胞の生存者を除去

>注:細胞通過は、細胞数を増やすためではなく、ニューロン細胞を除去するために必要です。グリアは数回分裂するだけで、通過後にそれ以上成長することはありません。細胞懸濁液を希釈しないでください。12ウェルプレートの1つのコンフルエントウェルのセルは、12ウェルプレートの1ウェルまたは24ウェルプレートの2ウェルに分配することができます。コーティングされたカバーガラスを使用する場合、カバーガラスの約3分の1しかコーティングされていません。したがって、24ウェルプレートに座っている6枚のカバースリップとコンフルエントセル(~80%-90%)は、12ウェルプレートのコンフルエントセルの1ウェルから得ることができます。他の比率も選択して、細胞密度を増減させることができます。このプロトコルでは、1 つの Cre+ レポーター マウスが使用されます [1 つの実験、2 つの処理: miR-25 または control-miR; 技術的複製 n = 3 (処理ごとに 3 つのカバースリップ)、生物学的複製 n = 1]。技術的反復数と生物学的反復数の定義は、実験デザインによって異なる方法が考えられます。

1. 細胞が90%〜100%コンフルエントであるかどうかを確認します(ウェルの縁にもあります。図3E、F)。
2. 培地を取り出し、HBSS(室温)1mLを加えて洗浄します。プレートを優しく揺らします(前後、左右)。HBSSを完全に削除します。
3. 予熱したトリプシン含有溶液500μL(金属ビーズ浴中で37°Cで予熱)を加えて、細胞をウェルから分離します。穏やかに(前後に、左から右に)揺さぶり、37°Cのインキュベーターで2分間インキュベートします。
4. プレートをインキュベーターからBSCに移動します。傾けながら、トリプシン含有溶液を吸引し、細胞が完全に剥離するまでウェル上に数回注意深くゆっくりと分散させます。プレートをライトに当てて、下部にセルが残っていないことを確認します。
5. この細胞懸濁液を滅菌済みの1.5mLチューブに移します。300 x gで4°Cで8分間遠心分離します。
6. 上清を取り除き、600 μL (6 ウェル/カバースリップでウェルあたり 100 μL) の予熱した増殖培地 (EGF を添加、1:1000) を加え、ピペッティングで ~30-40 回行って、細胞ペレットを慎重に再懸濁します
   手記：この時点で、細胞を-80°Cまたは液体窒素で凍結し、細胞株を解凍するための標準的なプロトコルに従って解凍することができます。細胞が凍結されている場合、EGFを添加した培地(増殖培地)に再懸濁されません。それらは、塩基性培地(EGFなし)および凍結溶液(1/1比)に再懸濁されます。
7. 600 μLの細胞/培地懸濁液100 μLを、24ウェルプレートの6つのコーティングされたカバースリップ(ステップ5を参照)の中央に置いて、細胞を播種します。プレートをインキュベーターに注意深く置き、細胞が落ち着くまで待ちます
   注:600 μLの細胞懸濁液(12ウェルプレートの1ウェルから採取)のうち100 μLは、トランスフェクションに必要な90%〜100%の細胞密度をもたらします。
8. 3時間後にセルをチェックして、セルがカバースリップに落ち着いたかどうかを確認します。EGF.
   を添加した増殖培地400 μLを添加します。 注:通常、細胞は通常、翌日にトランスフェクションの準備ができています(図3G)。コンフルエントでない場合(90%-100%)は、別の日に置いておきます。それでもコンフルエントでない場合は、トランスフェクションに使用しないでください。miRNAプロファイリング、RNA-Seq、RT-qPCR、ウェスタンブロットなど、他のダウンストリームアプリケーションを行う場合は、細胞を12ウェルプレート(1:1の比率、プレート処理は不要)に継代し、RNA/タンパク質抽出のために回収する必要があります。

結果

図 1:網膜解離とジェノタイピング。(A)角膜、水晶体、虹彩、硝子体を取り除いたアイカップ。(B)孤立した網膜。網膜色素上皮(RPE)細胞は、徹底的な洗浄後に除去されます。(C)解離した網膜を有する12ウェルプレート(ウェルごとに2つの網膜)。(D)ジェノタイピングゲル画像例の切り抜き。ジェノタイピングは、Ascl1 駆動の Cre リコンビナーゼ発現を持つマウスを同定する必要があり、細胞変換の追跡に使用されます。スケールバー:1mm。

図 2:一次ミュラーグリア培養の実験デザインと時間...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物
Ascl1-CreERTマウス Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	ジャックス研究所	#012882	Ascl1-CreERTマウスとtdTomatoマウスを交配しました
tdTomato-STOPfl/FLマウスB6.CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	ジャックス研究所	#007914	ジェノタイピングは、Ascl1CreER陽性マウスを同定するために必要と
試薬
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P4538-50MG	滅菌水、凍結アリコートで再構成
N-2サプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	〒17-502-048	冷凍アリコート
ニューロベースルミディアム	フィッシャーサイエンティフィック	21-103-049	セクション1.1の増殖培地に使用され、4°Cで保存
パパイン解離システム	ワージントン生化学	LK003153	アールの平衡塩溶液、冷凍アリコートで再構成
ペニシリンストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	15〜140〜122	冷凍アリコート
L-グルタミン	フィッシャーサイエンティフィック	〒25-030-081	冷凍アリコート
HBSSの	フィッシャーサイエンティフィック	14-025-134	4°Cで保存
ウシ胎児血清(FBS)	フィッシャーサイエンティフィック	MT35010CV	冷凍アリコート
プラスチック製品/消耗品
0.6 mL微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	50-408-120
1.5 mL微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	50〜408〜129
10 μL TIP滅菌フィルターピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-439
100 μL TIP滅菌フィルターピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-431
1000 μL TIP滅菌フィルターピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-404
2.0 mLマイクロ遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	50-408-138
20 μL TIP滅菌フィルターピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-432
容量可変ピペット(2.5、10、20、100、200、1000 μL)	エッペンドルフ	2231300008
使い捨てトランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-669*12
蓋付きマルチウェル平底プレート、ウェル数=12	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-29
蓋付きマルチウェル平底プレート、ウェル数=24	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-1
PIPET滅菌フィルター10ML使い捨て血清学的ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10J
PIPET滅菌フィルター50ML使い捨て血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10Q
PIPET滅菌フィルター5ML使い捨て血清学的ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10H
パウダーフリーのニトリル検査用手袋	フィッシャーサイエンティフィック	19-130-1597B
丸型カバースリップ(直径12mm、厚さ0.17〜0.25mm)	フィッシャーサイエンティフィック	22293232
真空フィルター 細孔径=0.22 μm	フィッシャーサイエンティフィック	09-761-106
備品
1300 B2バイオセーフティキャビネット	サーモサイエンティフィック	1310
オールインワン蛍光顕微鏡 キーエンス BZ-X 810	キーエンス	9011800000
双眼ズーム実体顕微鏡	ビジョン・サイエンティフィック	VS-1EZ-IFR07
使い捨てペトリ皿(直径100mm)	VWRの	〒25384-088
デュモン #5 鉗子 - バイオロジー/チタン	ファインサイエンスツール	11252から40
デュモン #55 鉗子 - Biologie/Inox	ファインサイエンスツール	11255から20
デュモン #7 湾曲鉗子 - バイオロジー/チタン	ファインサイエンスツール	11272から40
エッペンドルフ遠心分離機 5430 R	エッペンドルフ	2231000508
ウォータージャケット付きCO2インキュベーター	VWRの	10810-744

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