蛍光活性化核ソーティングを用いた脳組織からの細胞集団の単離

Abstract

出典:Mussa, Z., et al.蛍光活性化核ソーティングを使用した新鮮凍結皮質からの成体ヒトアストロサイト集団の単離。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、蛍光活性化核選別(FANS)を使用して、新鮮凍結ヒト脳組織から核を分離し、選別する手順を示しています。これにより、さまざまな神経学的応用のための異なる細胞集団の研究が可能になります。

Protocol

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. バッファーの準備

>注:ダウンストリームのRNAシーケンシングを行う場合は、mRNAの分解を防ぐために、すべてのワークスペースとツールをRNase除染溶液で徹底的に処理してください。

1. 溶解バッファーを調製します。
   1. 以下を蒸留水(H₂O)に50 mLまで溶解します:5.47 gのスクロース(最終0.32 M)、250 μLの1 M塩化カルシウム(CaCl₂)(最終5 mM)、150 μLの1 M酢酸マグネシウム(Mg(CH₃COO)₂)(3 mM最終)、10 μLの500 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(最終0.1 mM)、 500 μL の 1 M トリス塩酸 (Tris-HCl) (pH 8) (最終値 10 mM)、50 μL の Triton X-100 (最終値 0.1%) 、および 3 M ジチオスレイトール 17 μL (DTT、最終値 1 mM の最終値) 17 μL (材料表を参照)。
2. ショ糖緩衝液を調製
   1. 30.78 gのスクロース(1.8 M最終)、150 μLの1 M Mg(CH₃COO)₂(3 mM最終)、500 μLの1 M Tris-HCl(pH 8)(10 mM最終)、17 μLの3 M DTT(1 mM最終、新鮮に加える)を蒸留H₂Oに溶解します。

2. 凍結組織の単一核懸濁液への解離

1. 4 mLの氷冷溶解バッファーを7 mLのガラス製ティッシュダウンサー(グラインダー)に加え、氷上に保ちます。約200〜400 mgの新鮮凍結ヒト成人皮質を解剖し、約50倍にオンスし、組織ホモジネートを12 mLの超遠心ポリプロピレンチューブに移します。.
2. 5 mLピペットを使用して、スクロースと組織ホモジネートとの間の層を乱さないように注意しながら、6.5 mLの氷冷ショ糖緩衝液を超遠心チューブの底に加えます><。 注:追加のサンプルを処理する場合は、軽いサンプルに追加の溶解バッファーを追加して、チューブの重量バランスを慎重に取ります。超遠心チューブの正確なバランスをとることは、ローターの損傷を防ぎ、適切な速度で回転させるために不可欠です。

3. 超遠心分離

1. ライセートを24,400 rpm(101,814 × g)で4°Cで1時間超遠心分離します。ペレットを乱さずに上清と破片を慎重に吸引します
   手記：ペレットは、200 mg未満の組織から開始すると見えない場合があります。
2. 600 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(カルシウム(Ca²⁺)、マグネシウム(Mg²⁺)フリー)を核ペレットに加え、氷上で10分間インキュベートしてから再懸濁します。
3. ピペットで50回上下させて、核ペレットを氷上に再懸濁します。
4. 血球計算盤を使用して、顕微鏡下で無傷の核を視覚化し、次のステップに進む前に再懸濁液の濃度が10⁵ nuclei/mLを超えていることを確認してから進めます(再懸濁した核10 μLとトリパンブルー10 μLを組み合わせます)。

4. 抗体のインキュベーション

1. 蛍光活性化核ソーティング(FANS)のためにサンプルをイムノタグするには、再懸濁したサンプルペレット500 μL、1x PBS(Ca²⁺、Mg²⁺ free)490 μL、10%ウシ血清アルブミン(BSA)10 μL(最終0.1%)、AF(Alexa fluor)555(NeuN-AF555、最終濃度1:1000)に結合したマウス抗NeuN抗体1 μLを添加します。 アロフィコシアニン(PAX6-APC、最終濃度1:1000)に結合したマウス抗PAX6抗体1 μL
   手記：他の蛍光色素に結合した代替抗体を添加してもよい。ここでは、AF488(1:1000濃度)に結合したマウス抗OLIG2を使用し、良好な結果を得ました。
2. 必要に応じて少量のサンプルを使用して、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)のみおよび単色制御を実行して、ゲーティングパラメータを設定します。
   1. AF555の単色制御を行うには、再懸濁したサンプルペレット20 μL、1x PBS(Ca²⁺、Mg²⁺フリー)970 μL、10% BSA10 μL(最終0.1%)、およびNeuN-AF555抗体1 μL(1:1000濃度)を加えます。
   2. APC単色制御を行うには、再懸濁したサンプルペレット20 μL、1X PBS(Ca²⁺、Mg²⁺フリー)970 μL、10% BSA10 μL(最終0.1%)、およびPAX6-APC抗体1 μL(1:1000濃度)を加えます。
   3. DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)のみのコントロールを行うには、再懸濁したサンプルペレット20μL、1X PBS(Ca²⁺、Mg²⁺フリー)970μL、10%BSA(最終0.1%)10μL(DAPIは後で追加されます、4.4を参照)を追加します
      手記：2つ以上の抗体を使用する場合は、単色コントロールに加えて蛍光マイナス1(FMO)コントロールを行うことが推奨されます。
3. サンプルとコントロールを暗所で回転させて、4°Cで1時間インキュベー
トします。
4. 1:1000 の DAPI をすべてのサンプルとコントロールに追加し、ソートを続行します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS pH 7.2	インビトゲン	70013073
抗NEUN抗体クローンA60	ミリポア	MAB377A5MI	蛍光化合物AF555に結合したマウス抗NeuN(励起、553 nm、発光、568 nm)
抗オリッグ2抗体クローン211	ミリポア	MABN50A4MI	蛍光化合物AF488に結合したマウス抗OLIG2(励起、499 nm、発光、520 nm)
ウシ血清アルブミン	漁夫	BP9704-100
ブライトラインカウンティングチャンバー	ハウサーサイエンティフィック	3110ボルト
無水塩化カルシウム	漁夫	C614-3
セルストレーナー、40 μM	SPサイエンスウェア	136800040
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	インビトゲン	D1306
ダウンスティッシュグラインダー	ウィートン	357542
FACSソーター	BDバイオサイエンス		BD FACSアリアIII
酢酸マグネシウム四水和物	漁夫	M13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 テスト	ノーバス	NBP234705J
ショ糖、クリスタル認証、ACS、500 mg	漁夫	S5500
SW 41 Ti スイングバケットローター	ベックマン・コールター	331362
Tris-HCl、1M 溶液、pH 8.0、分子生物学グレード、超高純度	サーモサイエンティフィック	J22638AE
トリトンX-100	漁夫	BP151-500	溶解バッファー中の非イオン性界面活性剤
トリパンブルー溶液、0.4%	ギブコ	15250061
超遠心分離機	ベックマン・コールター オプティマ XE-100	A94516 の
超遠心チューブ PP 9/16 X 3-1/2	ベックマン・コールター	331372
UltraPure 蒸留水 (RNAse-, DNAse-free)	インビトゲン	10977023	蒸留水と呼ばれる
超高純度EDTA	ライフテクノロジー	15576から028