ラット海馬から種々の神経細胞集団を得る

要約

出典:Schwarz, J. M. Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、ニューロン、星状細胞、ミクログリアなどのラット海馬から細胞を分離するプロトコルを示しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ティッシュコレクション

1. Buffer Xにβ-メルカプトエタノールを最終濃度0.067 mMまで添加し、Neural Dissociation KitからBuffer Xを調製します(4サンプルにつき、13.5 μlの50 mM β-メルカプトエタノールを10 mLのBuffer Xに加えます)。
2. Neural Dissociation Kitのプロトコルに記載されているように、各サンプルに対して50 μlのEnzyme Pと1,900 μlのBuffer Xを混合して、Enzyme Mix 1を調製します。たとえば、4つのサンプルに対して、200 μlのEnzyme Pと7,600 μlのBuffer Xを混合します。
3. バッファーXを37°Cのウォーターバスに入れます。
2
4. mLの冷たいハンク緩衝塩溶液(HBSS)(Ca⁺⁺およびMg⁺⁺なし)を、各サンプルについて滅菌6ウェル培養プレートの1ウェルに入れ、収集して組織解剖のために氷上に保管します。

2. 神経解離 (1 時間)

1. 各組織サンプルを、6ウェル培養プレートの蓋にある滅菌済みのカミソリの刃を使用して、細かく刻みます。このプロトコルは、約30〜100 mgの組織サンプルに使用されていますが、最大400 mgの組織サンプルには承認されています。400 mgを超える組織サンプルの場合、試薬の量を適切にスケールアップする必要があります。
2. Ca²⁺およびMg²⁺を含まない新鮮なHBSS1 mLを使用して、さいの目に切った組織片をピペットで滅菌済みの2 mL遠心分離チューブに移します。すべてのサンプルが2 mLの遠心分離チューブに移されるまで、すべてのサンプルに対してステップ2.1と2.2を繰り返します。
3. サンプルを300 x gでRTで2分間遠心分離し、上清を吸引します。
4. ステップ1.2および1.3で調製した温かいEnzyme Mix 1 1,900 μlを各サンプルに加え、チューブを閉じます。
5. サンプルを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した組織片を再懸濁します。
6. その間に、20 μlのBuffer Yと10 μlの解凍したEnzyme Aを混合してEnzyme Mix 2を調製します(4つのサンプルに対して、80 μlのBuffer Yと40 μlの解凍したEnzyme Aを混合します)。
7. 各サンプルに30 μlのEnzyme Mix 2を加え、穏やかに反転させます。渦巻きにしないでください。
8. 各組織サンプルをパスツールピペット「1」で解離し、30回上下に粉砕します。
9. サンプルを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した組織片を再懸濁します。
10. 各組織サンプルをパスツールピペット「2」で解離し、気泡の発生を避けて30回上下に粉砕します。
11. 各組織サンプルをパスツールピペット「3」で解離し、気泡の発生を避けながら30回上下に粉砕します。
12. サンプルを37°Cのウォーターバスで10分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した細胞を再懸濁します。
13. 15 mLのファルコンチューブの上に置いた80ミクロンの細胞株にシングルセル懸濁液を塗布して大きな破片を取り除き、フィルターと細胞を10 mLのHBSS(Ca²⁺およびMg²⁺)で洗浄して酵素反応を停止します。各サンプルがきれいな15 mlのファルコンチューブに移されるまで繰り返します。
14. サンプルを300 x gでRTで10分間遠心分離し、上清を吸引します。

3. ミエリンの枯渇 (45分)

1. 細胞のペレットを400 μlのミエリン除去バッファーで完全に再懸濁します。
2. 指定量のミエリン除去ビーズとピペットを上下に添加して完全に混合します
   手記：使用されるミエリン除去ビーズの量は、組織のサイズ、動物の年齢、およびその特定の脳領域で予想されるミエリンの量によって異なります。例えば、成体ラットの海馬サンプル(約300 mg)の場合、サンプルを100 μlのミエリン除去ビーズとインキュベートします。
3. 4°Cの冷蔵庫で15分間インキュベートします。
4. 各サンプルを5 mLのミエリン除去バッファーで洗浄します。
5. サンプルを300 x gでRTで10分間遠心分離します。
6. サンプルを遠心分離しながら、各サンプルにつき1カラムを磁気選別機の磁場に置き、各カラムの上部にきれいな80ミクロンのフィルターを置きます。
7. カラムを調製し、各カラムを1 mLのミエリン除去バッファーで3回(合計3 mL)すすいでろ過します。すべてのフロースルーを、空のチップボックスの底などの廃棄物容器に集めます。
8. サンプル収集の準備のために、5 mLのポリスチレン丸底チューブを各カラムの真下に配置します。
9. 細胞の遠心分離が終了したら、上清を吸引し、500 μlのミエリン除去バッファーに再度完全に懸濁します。すぐに細胞懸濁液をカラムに塗布し、下のチューブに細胞を回収します。
10. フィルターとカラムを1 mLのミエリン除去バッファーで4回(合計4 mL)洗浄します。
11. セルコレクションを300 x gでRTで10分間遠心分離します。
12. 上清を吸引すると、細胞を染色する準備が整います。

4. FACSの生細胞の染色(染色に1時間)

1. 細胞を短時間ボルテックス(2秒)してペレットを分離し、直ちに5μlのFcブロック(抗分化クラスター32、CD32)を加え、再度ボルテックスし、4°Cの冷蔵庫で5分間インキュベー
トします。
2. 一方、洗浄バッファー100 μlごとに、アロフィコシアニン(APC)標識CD11b抗体(1:800)、抗GLT1抗体(1:100)1 μl、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-標識Thy1抗体(1:250)0.4 μlの3つの一次抗体を洗浄バッファーに添加して、一次抗体混合物を調製します。各サンプルには、インキュベーション用の一次抗体混合物100 μlが入られます。ただし、サンプルが400 mgの組織よりもはるかに大きい場合は、それに応じて一次抗体混合物の量を増やすことを検討することをお勧めします
3. 各サンプルチューブからわずか2 μlの細胞を取り出し、各シングル染色コントロールチューブに添加して、シングル染色コントロール用のチューブを調製します。「シングルステイン」コントロールには、APC-CD11bのみ、GLT1のみ、FITC-Thy1のみ、PE二次抗体のみ、および「ブランク」または未染色のコントロールが含まれます
   手記：すべてのサンプルは、すべての染色コントロールで表す必要があるため、各サンプルの細胞2 μlを各染色コントロールチューブに添加する必要があります。
4. チューブを短時間ボルテックスし (2 秒)、各サンプルチューブに 100 μl の一次抗体混合物を、各染色コントロールチューブに 100 μl の適切な一次抗体を加え、再度チューブをボルテックスし、チューブをアルミホイルで覆って蛍光抗体を光から保護し、チューブを 4 °C の冷蔵庫で 20 分間インキュベートします。サンプルと抗体の完全性を維持するために、残りの手順ではサンプルを冷却(4ºC)に保つ必要があります。
5. チューブを短時間ボルテックスし、各チューブに2mlの洗浄バッファーを追加します。
6. チューブを350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
7. その間、洗浄バッファー100 μlごとに0.2 μlのPE標識抗ウサギ二次抗体を添加して、二次抗体混合物を調製します。各サンプルには、100 μlの二次抗体混合物が入っています。ただし、サンプルが400 mgの組織よりもはるかに大きい場合は、それに応じて一次抗体混合物の量を増やすことを検討することをお勧めします。
8. 遠心分離が完了したら、各サンプルの上清をシンクに捨て、チューブを逆さまにしてペーパータオルで拭き取ります。
9. チューブを短時間ボルテックスし、各サンプルチューブに100 μlの二次抗体混合物を、各染色コントロールに適切な二次抗体を加えます。その後、チューブを再びボルテックスし、アルミホイルで覆い、4°Cの冷蔵庫で15分間インキュベートします
   手記：GLT1のみの染色コントロールチューブは、二次抗体混合物を採取する必要があります。
10. インキュベーション後、チューブを短時間ボルテックスし、各チューブに2 mLの洗浄バッファーを加えます。
11. チューブを350 x gで4ºCで5分間遠心分離します。
12. 遠心分離が完了したら、各サンプルの上清をシンクに捨て、チューブを逆さまにしてペーパータオルで拭き取ります。
13. チューブをボルテックスし、各チューブに0.25mlの滅菌PBSを追加します。サンプルは選別する準備ができています.
    手記： より多くの細胞は、0.5mlの滅菌PBSを必要とする場合があります。ただし、サンプルが細胞で濃縮されすぎると、サンプルは常に希釈されるため、少量から始めるのが最善です.
    手記：オプションでDNaseをチューブに添加して、細胞が凝集してソーターが詰まるのを防ぎます。サンプルは、ソーターの詰まりを防ぐために、ソーティングの直前に滅菌された80ミクロンフィルターを使用してろ過することもできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
神経解離キット(P)	ミルテニーバイオテック	〒130-092-628
ミエリン除去ビーズ II	ミルテニーバイオテック	〒130-096-733
LSカラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-401
QuadroMACS セパレータ	ミルテニーバイオテック	〒130-090-976
MACSマルチスタンド	ミルテニーバイオテック	〒130-042-303
ナイロンメッシュシート	アマゾン	CMN-0074-10YDの	40インチ幅、80ミクロンサイズメッシュ
FCブロック/アンチCD32	BDバイオサイエンス	BDB550270	ラットに対する反応性
APC標識CD11b抗体	バイオレジェンド	201809	ラットに対する反応性
ウサギ抗GLT1	ノーバスバイオロジカルズ	NBP1の20136	ラットまたはヒトに対する反応性
PE標識抗ウサギ二次抗体	eバイオサイエンス	1037259	抗GLT1の二次抗体
FITC標識抗ラットCD90(Thy1)マウス抗体	バイオレジェンド	202504	ラットに対する反応性