1. 細胞単離のための老化した線虫の調製と収集
- 線虫を採取し、細胞単離のためのバッファーを調製します。
- 15mLの円錐形チューブにワームを収集します。1.5 mLのM9バッファー(1 mM MgSO4、85 mM NaCl、42 mM Na2HPO4·7H2O、22 mM KH2PO4、pH 7.0)でプレートからワームを洗浄し、1,600 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、1 mLのM9バッファーでワームを洗浄します。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄して、大腸菌の汚染をできるだけ取り除きます
注:このステップでアンピシリンなどの抗生物質(50 μg/mL)を追加すると、細菌汚染を減らすのに役立ちます。
- 2つのサンプルについて、2 mLのドデシル硫酸ナトリウム-ジチオスレイトール(SDS-DTT)溶解緩衝液(200 mM DTT、0.25%(w/v)SDS、20 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(pH 8.0)、および3%(w/v)スクロース)を調製します。
- 15 mLの単離バッファー(118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、25 mM HEPES [pH 7.3])を調製し、氷上に保存します
手記：SDS-DTT溶解バッファーと分離バッファーは、各実験の前に新鮮にする必要があります。
- キューティクルの破壊とシングルセルの単離
- ステップ1.1.1で採取した動物を1,600 x gで5分間遠心分離します。すべての上清を取り除き、線虫を1 mLのM9培地に懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- ペレットワームを1,600 x gで5分間遠心分離します。
- 200 μLのSDS-DTT溶解バッファーを線虫に添加し、室温(RT)で5分間インキュベートします。線虫は、光学顕微鏡で見ると、体に沿って「ひねり」があるように見えるはずです
手記：SDS-DTT溶解バッファーに長時間曝露すると、線虫が死に至る可能性がありますが、これは線虫を観察することで監視できます。死んだワームは伸びてカールしません。
- 800 μLの氷冷アイソレーションバッファーを加え、チューブを穏やかにフリックして混合します。
- ワームを13,000 x g、4°Cで1分間ペレット化し、上清を除去し、1 mLのアイソレーションバッファーで洗浄します。
- 手順 1.3.5 を合計 5 回繰り返し、そのたびにアイソレーション バッファーを慎重に取り外します。
- 単離バッファーに溶解したStreptomyces griseus(15 mg/mL)(材料表)由来のプロテアーゼ混合物100 μLをペレットに加え、RT.
で10-15分間インキュベートします。
手記：SDS-DTT溶解バッファーと同様に、プロテアーゼ消化が長引くと、原形質膜に沿ったタンパク質が過剰に切断され、磁気ビーズによる表面露出した緑色蛍光タンパク質(GFP)の単離が妨げられる可能性があります。
- プロテアーゼ混合物とのインキュベーション中に、200 μLのマイクロピペットチップを使用して、1.5 mLの微量遠心チューブの底に対してサンプルを上下にピペッティングして、機械的破壊を施します。ピペットの先端を一定の圧力で微量遠心チューブの壁に当てて、細胞を適切に解離します。
- 消化の段階を決定するには、少量の消化混合物(~1-5 μL)を取り出し、スライドガラス上に落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。インキュベーションの5〜7分後、線虫の断片は目に見えてキューティクルが減少し、細胞のスラリーが容易に見えるようになります。
- 市販の低温LeibovitzのL-15培地900μLに10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン-ストレプトマイシンを添加した反応を停止します(50 U/mLペニシリンと50μg/mLストレプトマイシンでの最終濃度)。
- 10,000 x g、4°Cで5分間遠心分離することにより、断片および細胞をペレット化し、ペレット化した細胞を1 mLの冷たいL-15添加培地でさらに2回洗浄し、余分な破片およびキューティクルが除去されるようにします。
- ペレット化した細胞をL-15添加培地1 mLに再懸濁し、氷上に30分間放置します。最上層(約700−800μL)を微量遠心チューブに取ります。この層には細胞破片のない細胞が含まれており、その後の目的の細胞の単離に使用されます。
- 製造元の指示に従って、自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して、単離された細胞の10-25μLの細胞密度を測定します。
2. フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の単離
- フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の単離
- ステップ1.2.12で回収した単離細胞懸濁液から、10,000 x g、4°Cで5分間細胞を遠心分離し、上清を捨て、ペレット化した細胞をL-15添加培地に6 x 106細胞/mL以下の細胞密度で懸濁して、フローサイトメーターの過負荷を回避します。
- サンプルをソーティングできるフローサイトメーターを使用して、GFP陽性発現による細胞のソーティングを行います。GFP陰性細胞は、非細胞種特異的解析のコントロールとして使用できます。
- 単離細胞の培養
- 単離された細胞を滅菌済みの6ウェルマルチウェルプレートにプレート化します.
手記：これらのプレートは、細胞の接着を増加させるためにピーナッツレクチンでコーティングすることができます。ただし、セルをすぐに使用する場合は、この手順を無視してもかまいません。
- プレートをプラスチック容器に入れ、湿らせたワイプまたは軟ティッシュペーパーで細胞を20°Cでインキュベートします(ワイプ時に細菌が増殖しないように、50 μg/mLのアンピシリンを二重蒸留水[ddH2O]に加えます)細胞に水分を加えます。CO2インキュベーターでは、CO2レベルの上昇が細胞を損傷する可能性があるため、インキュベートしないでください。
