蛍光活性化細胞選別による線虫からのニューロンの単離

要約

出典:ドイツ、E.M.他回虫Caenorhabditis elegansからの特定のニューロン集団の分離。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、線虫Caenorhabditis elegansからの蛍光標識ニューロンの分離を示しています。細胞懸濁液は、コリン作動性ニューロンで蛍光タンパク質融合小胞膜トランスポーターを発現するように操作されたトランスジェニック線虫から得られます。次に、蛍光標識されたニューロンは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して単離され、培養物で維持されます。

プロトコル

1. 細胞単離のための老化した線虫の調製と収集

1. 線虫を採取し、細胞単離のためのバッファーを調製します。
   1. 15mLの円錐形チューブにワームを収集します。1.5 mLのM9バッファー(1 mM MgSO₄、85 mM NaCl、42 mM Na₂HPO₄·7H₂O、22 mM KH₂PO₄、pH 7.0)でプレートからワームを洗浄し、1,600 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、1 mLのM9バッファーでワームを洗浄します。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄して、大腸菌の汚染をできるだけ取り除きます
      注:このステップでアンピシリンなどの抗生物質(50 μg/mL)を追加すると、細菌汚染を減らすのに役立ちます。
   2. 2つのサンプルについて、2 mLのドデシル硫酸ナトリウム-ジチオスレイトール(SDS-DTT)溶解緩衝液(200 mM DTT、0.25%(w/v)SDS、20 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(pH 8.0)、および3%(w/v)スクロース)を調製します。
   3. 15 mLの単離バッファー(118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	12-556-004
寒天、分子生物学グレード	VWRの	A0930 (英語)
CaCl2	シグマ	C5670
Contess 自動セルカウンター	インビトゲン	Z359629
DTTの	USBiology(USBiology)	D8070
FBSの	オメガサイエンティフィック	FB-02
ヘープス	シグマ	H3375-J
KClの	アムレスコ	O395
KH2PO4	USBiology(USBiology)	P5110
キムワイプ	キンバリー・クラークの専門家	7552
リーボビッツのL-15ミディアム	ギブコ	21083027
MgCl2	シグマ	M8266
MgSO4	USBiology(USBiology)	M2090
Na2HPO4・7H2O	USBiology(USBiology)	S5199
NaCl	VWRの	X190 (英語
NaOCl(漂白剤)	クロロックス
NaOH	アムレスコ	O583
ペニシリン-ストレプトミセン	フィッシャーサイエンティフィック	15140122
ペプトンY	USBiology(USBiology)	P3306
プロナーゼE	シグマ	7433	Streptomyces griseus由来のプロテアーゼ混合物
SDSの	アムレスコ	O227
SMT1-FLQC蛍光実体顕微鏡	トライテックリサーチ
蔗糖	USBiology(USBiology)	S8010

型 名 の ) の 型 シリーズ