胚のひよこの脳からの小脳スライスの取得

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 鶏胚の解剖 14日目 (e14) 小脳

1. 褐色受精鶏の卵を38°Cで胚14日目までインキュベートします。
2. 卵はさみを使用して、卵でひよこの胚を斬首し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシャーレに頭を移します(図1A)。
3. 標準的な鉗子を使用して、各目の後ろに組織全体を切開し、目と上顎を切除します。咽頭全体を通して2回目の切開を行い、下顎を切除します(図1B)。
4. 標準的な鉗子を使用して、頭蓋骨の表面からすべての皮膚を剥がして(図1C)、前頭骨と頭頂骨を取り除き、脳を露出させます。
5. 腹側から、咽頭軟骨と補助間葉を取り除きます。
6. 背側からは、間葉を後脳に対して背側に慎重に取り除き、軟膜を傷つけないように注意しながら、脳全体を分離します(図1D)。
7. 中脳と後脳の間の組織全体を切開し、小脳を含む後脳を分離します(図1E)。
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8. 脳と後脳の鼻翼板の両側接合部で組織全体を切開することにより、小脳全体を切除し、解剖全体を通して軟膜の完全性を維持するように注意します(図1F)。また、形成中の脈絡叢を取り除きます(図1G)。
9. 解剖した小脳を氷冷したハンク平衡塩溶液(HBSS)に移します。

>2. e14 Cerebellumのスライス培養

1. スパチュラまたは3mlのパスツールピペットを使用して、小脳全体をティッシュチョッパーの滅菌プラットフォームに移し、先端を切り取って開口部を広げます。ピペットを使用して余分な液体を取り除きます。
2. ティッシュチョッパーセットを使用して、最大50%の切断速度で、必要な向きで小脳全体を300μmの厚さで切断します。組織の完全性は、矢状切片で最も簡単に保存されます。ただし、細胞解析では配向も重要な考慮事項です(プルキンエ細胞樹状突起は矢状に整列していますが、顆粒細胞の軸索はプルキンエ細胞樹状突起の平面に対して垂直に横方向に走っています)。
3. 3mlのパスツールピペットを使用して、スライスした小脳を氷冷HBSSで覆います。
4. HBSSのスライスを、先端がカットされた3mlのパスツールピペットを使用して、氷冷した新鮮なHBSSが入った60mmのシャーレに移します。
5. 光ファイバー光源で照らされた解剖顕微鏡の下で、時計メーカーの鉗子を使用して個々のスライスの分離を確認します.
   手記：胚から培養液でのスライスインキュベーションまでの各解剖には、経験にもよりますが、約10〜20分かかります。一度に1つずつ解剖を行い、小脳が斬首から生体外培養までの間に最小限の時間を費やすようにします。

図 1.E14ニワトリ胚からの小脳の解剖。(A)卵の中のひよこを斬首し、氷冷したPBSを入れたシャーレに頭を移します。目の後ろと咽頭(破線)を切開して下顎と目を切除します。(B)頭蓋骨の表面から皮膚を取り除きます。(C)前頭葉と頭頂骨を取り除き、(D)脳を周囲の間葉と軟骨から取り出します。(E)解剖顕微鏡下で、脳の後端にある小脳の位置を特定します。中脳と後脳(破線)の間を切断して、小脳と腹側後脳を残します。(F)小脳の側方接合部(脚)に切開を行い、小脳を後脳から分離します(破線)。(G)小脳の腹側から脈絡叢(アスタリスク)を取り除き、小脳全体が無傷で視膜が付着するまで残します。ティッシュチョッパーでスライスを調製する前に、小脳を氷冷HBSSに移します。