マウス脊髄からの初代混合グリア細胞培養の確立

要約

出典:Malon, J. T., et al. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、成体マウスの脊髄組織から一次混合グリア細胞を単離し、培養する技術を示しています。このプロトコルでは、組織の酵素消化を行い、続いて壊れた細胞膜とミエリン破片を除去して単一細胞集団を取得します。次に、細胞を混合グリア細胞の増殖に最適化された培地で培養します。

プロトコル

1. 無菌条件下での培養フード内の溶液の調製

1. 培地の調製:DMEM(4.5 g/Lグルコース)、10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン、250 ng/mLアムホテリシンB、および50 μM 2-メルカプトエタノール(2-ME;1.1.1参照)を含むイーグル培地(cDMEM)のダルベッコ修飾を完了します。他のすべての成分を混合してろ過滅菌し、FBSを添加します。培地は4^°Cで保存してください。
   1. 50 mM 2-ME/リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ストック溶液を調製する:100 μLの濃縮2-ME(14.3 M)を28.6 mLの1x PBSに加え、ろ過滅菌します(溶液は4^°Cで数ヶ月間保存できます)。培地1,000 mLごとに1 mLの2-MEストック溶液を使用してください。
2. 密度勾配培地の調製
   1. 1部の10x通常の滅菌PBSと9部の滅菌ストック密度勾配培地(Percollなど)から、ストック等張密度勾配培地溶液(例:100% Percoll)を調製します。
   2. 100%密度勾配培地(1.2.1製)を通常の1倍滅菌PBSで希釈して20%密度勾配培地(例:100 mLの100%濃度勾配培地と40 mLの1x PBSを含む)を調製し、4^°Cで保存します。細胞培養を調製する前に、20%密度勾配培地を室温(RT)に戻します。
3. パパイン解離系からの溶液の調製
   注:パパイン解離システムは、材料テーブルで識別できます。他の同様の解離キット(社内で組み立てられたものを含む)も使用できます。すべてのコンポーネントは無菌でなければなりません。
   1. 32 mLのEarle's Balanced Salt Solution(EBSS)をオボムコイド阻害剤混合物(粉末)に加えます。.
   2. 5 mLのEBSSを1つのパパインバイアル(粉末)に加えます。パパインバイアルを37^°Cのウォーターバスに10分間、またはパパインが溶解するまで置きます。
   3. 500 μLのEBSSを1つのDNaseバイアル(粉末)に加えます。やさしく混ぜます。
   4. 250 μLのDNase溶液(上記)をパパインバイアルに加えます。
   5. 必要な上記のパパイン/DNase混合物の総量(マウス脊髄あたり約800μLのパパイン/DNase混合物)を計算し、必要な混合物を組織消化のために50mLチューブに移します。残り物は元のバイアルに入れて4°Cで少なくとも2週間保管します。
   6. キットのすべてのコンポーネントは、必要になるまで氷の上に置いておきます。
4. 脊髄採取チューブを準備します:5 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS;パパイン解離システムから、脊髄を採取するためのもの)を含む滅菌15 mLチューブ1本と、1x PBSを含む滅菌15 mLチューブ1本(5 mLシリンジを充填するため)を準備します。さらに、5mLのHBSSを含む滅菌ペトリ皿(35mmまたは60mm)を1枚調製し、培養フードに保管します。

2. シングルセル懸濁液の調製

>注:すべてを無菌に保つために、培養フードでステップ3と4を実行します。

1. すべての脊髄をHBSS含有シャーレに移します。滅菌ハサミと鉗子で、各脊髄を多くの細かい小さな部分に切ります。滅菌鉗子または10mLピペットを使用して、調製したパパイン/ DNase酵素混合物(ステップ1.3.5)を含む50mLコニカルチューブに脊髄組織を移します(調製した酵素溶液をさらに希釈し、酵素の性能を低下させる可能性があるため、酵素混合物にHBSSを添加することは避けてください)。
2. チューブを優しく渦巻きにして混ぜます。チューブを37^°Cで1時間インキュベートし、150rpmでオービタル振とうを行います。
3. チューブを再度ボルテックスし、5mLピペットを使用して酵素溶液を組織と激しく粉砕し、さらなる解離を促進します。
4. 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、室温で300 x gで5分間遠心分離します。
5. 遠心分離中に、2.7 mLのEBSSを300 μLの再構成アルブミン-オボムコイド阻害剤溶液(1.3.1)と滅菌チューブ内で混合します。DNase溶液150μLを添加します(ステップ1.3.3)。
6. 遠心分離後、上清を除去し、上記で調製した溶液で細胞ペレットを再懸濁します(ステップ1.5)。細胞ペレットを破砕するためによくボルテック
スします。
7. 再構成したアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液3mL(ステップ1.4.1)を細胞懸濁液に加えます。細胞を70 x gで6分間RTで遠心分離し、上清(膜断片を含む)を取り除きます。

>3. 単一細胞懸濁液からのミエリンのさらなる除去

1. 細胞ペレットが入ったチューブに8 mLの20%密度グラジエント培地(ステップ1.2.2で調製)を加え、ペレットを穏やかにボルテックスして破壊し、ブレーキをかけずに細胞を800 x gでRTで30分間遠心分離します。破片の最上層(主にミエリン)と上澄みを慎重に取り除きますが、ペレットは保持します。
2. 密度勾配の残りを除去するには、細胞ペレットを希釈したcDMEM8 mL(cDMEM1部とHBSS部2)で再懸濁して細胞を洗浄します。細胞を400 x gで4^°Cで10分間遠心分離し、上清を取り除き、希釈したcDMEM(上記)で同じ方法で細胞を再度洗浄します。細胞を播種するまで、細胞を氷の上に置いておきます。
3. 上清を除去し、細胞ペレットを培養培地(2-MEに付属のcDMEM(ステップ1.1で調製))に再懸濁します。12ウェルプレート1枚につき、3 mL x 4(使用したマウスの数)+ 2 mL = 14 mL培地を使用します。これにより、プレート全体(12ウェル)に十分な細胞懸濁液が確保され、ウェルあたりの平均細胞数と培養物のミクログリア含有量を決定するために使用できる追加のウェルが提供されます。他の種類の培養容器を使用する場合は、必要な培地の総量を比例して計算します。
4. 1 mLの細胞懸濁液を12ウェルプレートの各ウェルに加えます。
5. 細胞を35.9^°Cで5%CO₂とインキュベートします。
6. D 1 で培地を交換し (吸引して古い培地を取り除き)、その後 3 - 4 日ごとに交換します (通常は D: 1、4、8、および 11 で培地を交換し、12 日目にセルを使用します)
   手記：1日目には、脊髄組織からの残留物ミエリンにより、培養物にかなりの量の破片が含まれている可能性があります。したがって、1日目にメディアを交換することをお勧めします。培養物はD 12 - 14の間の治療の準備ができています。細胞は通常、D 12で80%コンフルエントであり、D 14までに100%近くコンフルエントになることがあります。通常、D 12では、12ウェルプレートにウェルあたり約100,000個の細胞があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4.5 g/L グルコースによる Eagle 培地 (DMEM) のダルベッコによる	ロンザ	12-709階	cDMEM培地は、広く使用されている標準的な培地です. 個々の研究者は、DMEMおよびcDMEM培地の製造に使用される他のすべてのコンポーネントをどこで購入するかを決定できます。
L-グルタミン (100x)	ロンザ	17-605E	L-グルタミンは、さまざまな培地に広く使用されている標準成分です。L-グルタミンをどこで購入するかは、個々の研究者が決めることができます。
抗生物質-抗真菌薬溶液(100x)	コーニングメディアテック	30-004-CIの	これは、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンの組み合わせで、10,000ユニット/mLのペニシリンG、10 mg/mLのストレプトマイシン硫酸塩、および25 μg/mLのアムホテリシンBを含むように処方されています。
2-メルカプトエタノール(2-ME)	シグマ・アルドリッチ	M3148	細胞培養、分子生物学、電気泳動に適したBioReagentです。
パパイン解離システム	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LK003150	このキットの個々のコンポーネントは別途購入できます。
パーコール	GEヘルスケア	17-0891-01	パーコールは滅菌溶液として販売されています。希釈されていないパーコールは、必要に応じて再オートクレーブ滅菌できます。
ラボラインインキュベーター/シェーカー	バーステッド/ラボライン	マックスQ4000	これが現在私たちが持っているインキュベーター/シェーカーです。代わりに他のタイプのシェーカーを使用することができます。

修飾