耳前駆細胞の感覚上皮細胞への分化とそれに続く免疫染色

要約

出典:Azadeh, J. et al., 不死化多能性耳前駆細胞における分化の開始.J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)細胞の感覚上皮細胞への分化を示しています。iMOP細胞の培養、耳圏の形成、分化の誘導、および細胞分化の成功を確認するための蛍光顕微鏡による細胞成分と分化マーカーの視覚化に関与するステップを概説します。

プロトコル

1. IMOP細胞の自己複製の維持

1. iMOP培地を調製:DMEM/F12、1X B27サプリメント、25 μg/mlカルベニシリン、20 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)。無菌試薬を使用して50 mLのiMOP培地を調製します。49 mLのDMEM/F12を50 mLの円錐形に入れ、37°Cの水浴で温めます。
   1. 50X B27サプリメントを解凍し、100 mg/mlカルベニシリンアリコートを37°Cの水浴で5分間フィルター滅菌します。100 μg/ml bFGFアリコートをRTで解凍し、50X B27 1 mL、100 μg/ml bFGF10 μl、100 mg/mlカルベニシリン12.5 μlをDMEM/F12に加えます。
2. 60 mmの組織培養皿に3 mLの培地を入れて、iMOP細胞を培養します。一日おきに新鮮な培地を培養物に加え、培地の量を2倍にします。bFGFの濃度が5 ng/mlを下回らないようにしてください。
   1. iMOP細胞を5%COで37°Cで培養します_。以下の手順に記載されているように、5〜7日後に細胞を培養します。10 mLのピペットチップを使用して、培養物を15 mLの円錐形に移します。
3. 0.1 mLの0.5 M EDTA(pH 8.0)を50 mLのHBSSに希釈して、HBSSで1 mM EDTAを調製します。HBSS製の1 mM EDTAを37°Cのウォーターバスで予温します。
4. 重力沈降または遠心分離により、200 x gで室温で5分間細胞を回収します。重力沈降の場合は、培養物を含む15 mLの円錐形を37°Cのインキュベーターに5〜10分間置きます。その後、耳球が15mlの円錐形の底に集まるのを観察します.
   手記：過度の遠心力は細胞の損傷を引き起こす可能性があります。
5. 2 mLの吸引ピペットを使用して、細胞ペレットを乱さずに使用済み培地を慎重に吸引します。温めた1 mM EDTA HBSS溶液0.5 mLを細胞ペレットに加えます。P1000ピペットを使用して、2〜3回ゆっくりと上下します。円錐形を37°Cで置き、<5分間インキュベートして、単一細胞への解離を促進します。
6. 細胞溶液を静かに渦巻かせて、耳球が解離しているかどうかを判断します。耳球が円錐形の底に沈殿物がない場合、細胞は解離します。孵化時間は異なる場合があります.
   手記：EDTAとのインキュベーションが長引くと、過剰な細胞死が生じます。
7. 細胞を37°Cから取り出し、2 mLの培地を加えてEDTAを中和および希釈します。200 x gで5分間遠心分離し、RTで細胞を回収し、2 mLの吸引ピペットを使用して希釈したEDTAを吸引し、5 mLの1X PBSを加えて細胞を洗浄します。
8. 細胞を200 x gで5分間室温でスピンダウンし、2 mLの吸引ピペットを使用して1X PBSを吸引します。P1000ピペットを使用して、0.5 mLのiMOP培養培地に細胞を2〜3回静かに上下させて再懸濁します。
9. 適切なカセットを備えたマイクロ流体粒子カウンターを使用して細胞をカウントします。iMOP セルのコンフルエント プレートには、~6 個の X10⁶ セルが含まれます。細胞を培地で1:100に希釈し、75 μlの細胞溶液をカセットに加えて計数します。6 cmのディッシュに1 x 10⁶個の細胞をiMOP培地でプレートします(~1:10希釈)。Passage iMOPは5〜7日ごとに.
   手記：大きな耳球を形成する細胞や、組織培養皿の底に付着する細胞は分化します。また、培養物が過度にコンフルエントになると、細胞は死滅します。

2. IMOP細胞の感覚上皮への分化

1. 50 mLのiMOP感覚上皮分化培地を調製します:DMEM/F12、1X B27サプリメント、25 μg/mlカルベニシリン。50mlのiMOP感覚上皮分化培地を作製します。49 mLのDMEM/F12を50 mLの円錐形に入れ、37°Cの水浴で温めます。50X B27サプリメントと100 mg/mlカルベニシリンアリコートを37°Cの水浴で5分間解凍します。50X B27 1 mLと100 mg/mlカルベニシリン12.5 μlをDMEM/F12に加えます。
2. 細胞の採取、解離、再懸濁、およびカウントを行うには、手順1.4〜1.9を繰り返します
3. -3日目にiMOP培地を使用して、6cmの皿に1 x 10⁶個の細胞をプレートします。0日目に、10 mlピペットを使用して培養物を15 mlの円錐形に移します。ステップ1.6で述べたように、重力沈降によって耳圏を収集します。2mlの吸引ピペットを使用して使用済み培地を吸引し、耳球を円錐形の底に置きます。
4. 2mlの感覚上皮分化培地を穏やかに加えます。大口径10mlピペットを使用して耳球を6cmディッシュに移します.
   手記：過酷なピペッティングによる機械的なせん断は、細胞を耳球から解離させる可能性があります。
5. 2 mLの新鮮な感覚上皮分化培地を隔日で培養液に加えます。必要に応じて、細胞を重力沈降法および交換培地によって収集することができる。
6. 10日目に15 mlの円錐形に移し、ステップ1.6で述べたように耳圏を沈殿させることにより、耳圏を収集します。2mlの吸引ピペットを使用して使用済み培地を吸引し、耳球を邪魔しないようにしておきます。
7. RTで1X PBSの4%ホルムアルデヒドで15分間インキュベートすることにより、耳球を固定します。ホルムアルデヒド溶液を除去し、洗浄バッファー(0.1% TritonX-100を含む1X PBS)で耳球を洗浄してから、ブロッキングバッファー(10%の正常なヤギ血清と0.1%Triton X-100を含む1X PBS)で1時間インキュベートします。
   1. バッファーを交換し、ブロッキングバッファー中のサンプルを希釈した抗体とインキュベートします。4°Cでインキュベートし、0.1% Triton X-100を含む1X PBSでサンプルを洗浄し、耳圏を免疫染色します。耳球を1X PBSに移し、P1000ピペットを使用してスライドガラス上の封入剤に耳球をセットします。サンプルにカバースリップを貼り、封入剤を4°Cで乾燥させます。
8. 16ビットCCDカメラと20X 0.75空気または40X 1.3 NAの油浸対物レンズを装備した倒立顕微鏡セットアップを使用して落射蛍光画像を取得します。青色(377 ± 25 nm/447 ± 30 nm)、緑色(475 ± 25 nm/540 ± 25 nm)、赤色(562 ± 20nm/および625 ± 20nm)、赤外線(628 ± 20nm/および692 ± 20 nm)に記載されている(励起および発光)波長を使用して、さまざまなカラーチャネルから蛍光を収集します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 厚さガラスカバースリップ (丸型 12 mm)	電子顕微鏡科学	72230から01
DMEM/F12	ライフテクノロジー	11320-082
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4	ライフテクノロジー	〒10010-023
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	ライフテクノロジー	14025-092
B27サプリメント(50X)セラムフリー	ライフテクノロジー	17504-044	1mlのアリコートとして保存
Prolong Gold 退色防止封入剤	ライフテクノロジー	47743-736	10 mg/ml 100 μl アリコートとして保存
Moxi Z Mini自動セルカウンター	オルフロー	MXZ001
モクシーZ カセット Type S	オルフロー	MXC002
組換えマウス線維芽細胞増殖因子、塩基性(bFGF)	ペプロテック	450-33	H20 の 0.1% BSA に再懸濁し、20 mg/mL アリコートとして保存
カルベニシリン、二ナトリウム塩	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP2648-1	10 mM Hepes pH 7.4に再懸濁し、100 mg/mL アリコートとして保存
5mlピペット個包装文庫本(200本/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811D
10mlピペット個包装ペーパーバック(200本/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811E
組織培養処理6cm皿	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130181
TipOneフィルターピペットチップ0.1-10 ul細長いフィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1120-3810
TipOneフィルターピペットチップ1-20 ulフィルターチップ	USAサイエンティフィック	1120-1810
TipOneフィルターピペットチップ1-200ulフィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1120-8810
TipOneフィルターピペットチップ101-1000ulフィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1126-7810
15 mlコニカルチューブ滅菌25チューブ(500チューブ)の20袋	USAサイエンティフィック	〒1475-0511
50mlの円錐管は25本のチューブ(500本のチューブ)の20袋を滅菌します	USAサイエンティフィック	1500-1211

しました。 しました。 年