不死化多能性耳前駆細胞の螺旋神経節ニューロンへの分化と分化の評価

要約

出典:Azadeh, J., et al. 不死化多能性耳前駆細胞の分化開始。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)のスパイラル神経節ニューロン(SGN)への分化と、免疫蛍光法に基づく分化の確認を示しています。iMOPは、SGNへの分化のために、ニューロン分化培地中の培養基質コーティングされたカバースリップに播種されます。分化した細胞は、神経細胞の分化マーカーに特異的な抗体で標識され、顕微鏡で分析されて分化を確認します。

プロトコル

1. iMOP由来ニューロンの区別

1. 神経細胞分化培地50mlを調製する:神経基礎培地、B27サプリメント1個、L-グルタミン2m。50X B27と200 mM L-グルタミンのボトルを37°Cのウォーターバスで5分間解凍します。50X B27 1 mL と 200 mM L-グルタミン 0.5 mL を 48.5 mL のニューロベース培地に加えます。
2. 滅菌済みの10cmプレートに12mmの丸い1.5ガラスカバースリップを配置してカバーガラスをコーティングし、プレートに70%エタノール(EtOH)を加えてカバースリップを滅菌して清掃します。
3. カバースリップを静かに攪拌して、カバースリップがエタノールで覆われていることを確認します。プレートを室温で10分間放置し、滅菌済みの1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でカバースリップを3回すすぎ、残りのエタノールを洗い流します。カバーガラスを滅菌済みのH₂Oで一度すすぎ、残りの1X PBSを洗い流します。
4. 2 mlの吸引ピペットを使用してH₂Oを吸引し、カバースリップを乾かします。カバースリップを組織培養フード内でUV光に15分間さらします。カバースリップは、すぐに使用しない場合は無菌環境で保管してください。
5. 12 mmの丸いカバースリップを1枚、24ウェルディッシュの各ウェルに入れます。プレートを静かに振って、カバーガラスがウェルの底に平らになるようにします。
6. 2 mg/mLのポリ-D-リジン原液を室温(RT)で解凍し、1X PBSで10 μg/mlのポリ-D-リジン濃度に希釈します。0.25 mlの10 ug / mlポリD-リジンをウェルに加えます。.プレートを37°Cのインキュベーターに1時間放置します。
7. ウェルを滅菌済みの1X PBSで3回洗浄します。10 mg/mlのラミニン原液をRTで解凍し、1X PBSで10 μg/mLに希釈します。0.25 mLの10 μg/mlラミニン作動溶液を24マルチウェルディッシュの1ウェルに加えます。プレートを37°Cインキュベーターでインキュベートします。2 mLの吸引ピペットを使用してラミニン溶液を吸引します。
8. P1000ピペットで1 mLの1X PBSを加え、2 mLの吸引ピペットで1X PBSを取り外して、カバーガラスを1X PBSで3回洗浄します。細胞をプレーティングする準備ができるまで、最後の洗浄からウェルに1X PBSを放置します。細胞を採取、解離、カウントすることにより、ニューロンの分化を開始します。 -3日目に6cmの皿に1 x 10⁶細胞をプレートします。
9. 0日目に、細胞を採取し、解離し、カウントします。1 x 10⁵ - 1.5 x 10⁵ iMOP細胞を、ウェルあたり0.5 mLの温めた神経分化培地に播種し、24マルチウェル皿に入れます。予め温めたニューロン分化培地を吸引し、一日おきに培養液に加えます。
10. iMOP由来ニューロンを4%ホルムアルデヒドに15分間固定します。ホルムアルデヒド溶液を取り出し、iMOP由来ニューロンを洗浄バッファー(0.1% TritonX-100を含む1X PBS)で洗浄してから、ブロッキングバッファー(10% normal goat serum and 0.1% Triton X-100を含む1X PBS)で1時間インキュベートします。
    1. バッファーを交換し、ブロッキングバッファー中のサンプルを希釈した抗体とインキュベートします。4°Cでインキュベートし、0.1% Triton X-100対象細胞を含む1X PBSでサンプルを免疫染色します。封入剤にセットする前に、カバーガラスを1X PBSで洗浄してください。封入剤を4°Cで乾燥させてから、落射蛍光画像を取得してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 厚さガラスカバースリップ (丸型 12 mm)	電子顕微鏡科学 7	72230から01
DMEM/F12	ライフテクノロジー	11320-082
ニューロベースルミディアム	ライフテクノロジー	21103
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4	ライフテクノロジー	〒10010-023
B27サプリメント(50X)セラムフリー	ライフテクノロジー	17504-044	1mlのアリコートとして保存
L-グルタミン(200 mM)	ライフテクノロジー	〒25030-081	5mlのアリコートとして保存
ナチュラルマウスラミニン	ライフテクノロジー	23017-015	1 mg / mlアリコートとして保存
Prolong Gold 退色防止封入剤	ライフテクノロジー	47743-736	10 mg/ml 100 μl アリコートとして保存
Moxi Z Mini自動セルカウンター	オルフロー	MXZ001
モクシーZ カセット Type S	オルフロー	MXC002
ポリ-D-リジン	シグマ	P7886	1X PBSに再懸濁し、10 mg/ml 100 μlアリコートとして保存
5mlピペット個包装文庫本(200本/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811D
10mlピペット個包装ペーパーバック(200本/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811E
組織培養処理バイオライト24ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130188
組織培養処理バイオライト6ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130184
組織培養処理6cm皿	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130181
EMD Millipore Millex 滅菌シリンジ PVDF フィルター 細孔径: 0.22 μm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SLGV033RS
TipOneフィルターピペットチップ0.1 - 10 μl細長いフィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1120-3810
TipOneフィルターピペットチップ1 - 20μlフィルターチップ	USAサイエンティフィック	1120-1810
TipOneフィルターピペットチップ1 - 200 μl フィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1120-8810
TipOneフィルターピペットチップ101 - 1000 μlフィルターチップ	USAサイエンティフィック	〒1126-7810
15 mlコニカルチューブ滅菌25チューブ(500チューブ)の20袋	USAサイエンティフィック	〒1475-0511
50mlの円錐管は25本のチューブ(500本のチューブ)の20袋を滅菌します	USAサイエンティフィック	1500-1211