蛍光活性化細胞選別を用いたマウス網膜神経節細胞の単離

要約

出典:Chintalapudi, S. R., et al.フローサイトメトリーによる初代マウス網膜神経節細胞(RGC)の単離。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用してマウスの初代網膜神経節細胞(RGC)を単離する手順を示しています。この方法は、神経変性疾患における機能的なRGCの喪失に起因する視力の大幅な低下をよりよく理解することを目標に、RGCの将来の研究を可能にします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 機器、溶液、およびメディアの準備

>注:プロトコールで報告される材料、試薬、ツール、および機器に関するすべての情報は、材料の表に指定されています。

1. すべての解剖器具をオートクレーブ処理し、無菌エリアに保管します。次の器具を使用してください:4つの標準鉗子(2つの長い鉗子と2つの短い)と2つのはさみ、2つの鉗子(1つの長い鉗子と1つの短い)と1つのはさみを解剖用します。バックアップとして追加のセットを保持します。
2. 100 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/1%ウシ胎児血清(FBS)溶液を調製し、洗浄、免疫標識手順、および細胞選別ステップで使用します。溶液を4°C.
   で冷やしておきます。 手記：アジ化ナトリウム(NaN₃)は、生細胞に毒性を及ぼす可能性があるため、溶液に添加しないでください。
   1. 100 mLのPBS/1% FBSを、99 mLのPBSと1 mLのFBSと共に調製します。
3. 3% FBS(材料表を参照)を添加した滅菌神経細胞培地100 mLを調製し、コレクションおよび培養培地として使用します。細胞培養培地は4°Cで無菌状態に保ちます。使用前に室温(RT)まで温めてください。
   1. 97 mLの神経細胞培地と3 mLのFBSを使用して、3% FBSを添加した100 mLの神経細胞培地を調製します。
4. 5 mLの収集培地で事前にコーティングされた収集チューブ(15 mLチューブ)を氷のバケツに入れて事前に冷却します。細胞がチューブ表面に付着するのを防ぐために、ポリプロピレンチューブのみを使用してください。
5. 40 mmディッシュ、70 μmナイロンストレーナー、シリンジ、セルストレーナー用乳棒、および滅菌ポリプロピレンチューブをバイオセーフティキャビネットに入れます。手順の前にすべてのアイテムを滅菌し、手順全体を通して無菌状態でそれらを維持します。
   手記：網膜の収集後のすべての手順は、バイオセーフティキャビネットで実行されます。

2. 網膜細胞懸濁液の調製

1. 採取した眼を解剖顕微鏡のベースプレートに置き、角膜解剖を開始します。各目を個別に解剖します。
2. 鉗子を使用して、球体を視神経基部で慎重に保持します。このステップでは、長い鉗子と短い標準鉗子を1つずつ使用します。
3. 30ゲージ(30G)の鋭利な針を使用して角膜に穴を開けます。これにより、房水が目から排出され、鉗子で目を保持しやすくなります。
4. 鉗子で角膜を保持し、はさみを使用して角膜に小さな切開を行います。鉗子を使用して角膜と強膜をやさしく剥がします。球体を半分まで剥がしたら、鉗子を使用して網膜とレンズを広げます。角膜、強膜、水晶体を捨てます.
   手記：この方法により、網膜が目の残りの部分から完全に分離します。
5. PBS/1% FBS.
   を含む小さな 40 mm シャーレに網膜を置きます。 手記：ペトリ皿の代替として、細胞培養皿を使用することができます。生理学的条件と同様に、常に網膜を湿らせておくようにしてください。
   1. バイオセーフティキャビネット内で、新鮮な滅菌PBS/1%FBSで各網膜を3回洗浄します。
6. PBS/1% FBSで湿らせた滅菌済みの70μmナイロンストレーナーに最大12個の網膜を配置します。10 mLシリンジの後端を使用して、円を描くようにして網膜を優しく浸軟させ、細胞を剥離します。
   1. あるいは、細胞ストレーナー浸軟に乳棒を使用するか、15 IU/mL パパイン、5 mM L-システイン、および 200 U/mL DNase I を 37 °C で 15 分間組み合わせて酵素消化を行い、その後 PBS/10% FBS.
      で不活性化します 手記：酵素消化をシリンジの後端または乳棒による浸軟と比較した場合、回収された細胞の割合に変化は観察されませんでした。
7. 単離した細胞を移すには、滅菌済みの70μmナイロンストレーナーをポリプロピレン製採取チューブの上に置きます。P1000ピペットを使用して、収集した細胞をストレーナに通します。ストレーナをPBS / 1%FBSですすいで(ステップ3.6)、残りのセルを放出し、それらを収集チューブに移します。
8. PBS/1% FBSを添加して、網膜あたり1 mLの最終容量を達成します。細胞懸濁液を200 x gおよびRT.
   で7分間遠心分離します。 注:浸軟した網膜の数(<6網膜)によっては、細胞ペレットが小さすぎて見えない場合があります。
   1. 細胞上清を捨て、細胞ペレットをPBS/1% FBSに再懸濁します。これは、5レチネあたり1 mLの比率で行います。
9. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
   1. ガラス製の血球計算盤を清掃し、70%アルコールで覆います。細胞を含むチューブを静かに渦巻き、網膜細胞懸濁液が均一に分布していることを確認します。0.4%トリパンブルー20μLを微量遠心チューブに入れ、細胞懸濁液20μLと混合します。
   2. 穏やかに混合し、0.4%トリパンブルー/細胞懸濁液ミックス10μLを血球計算盤に塗布し、両方のチャンバーを満たします。毛細管現象により、0.4%トリパンブルー/細胞懸濁液ミックスがカバーガラスの下に引き込まれます。顕微鏡を使用して、すべてのトリパンブルー陰性細胞を数えます。この番号は生細胞を表します。
   3. 次の式を使用して細胞生存率を決定します:生細胞数/総細胞数=%生存率.
      手記：細胞の生存率が95%未満の場合、蛍光活性化細胞選別(FACS)中に細胞生存率を区別するために蛍光色素が必要です。
10. 生細胞に透過性のない蛍光生存率色素を使用してください。細胞をPBSで洗浄して、血清の痕跡を取り除きます。最終容量100 μL中に5.0 x 106細胞あたりの細胞生存率識別用の蛍光色素1 μLを添加します。光から保護して、室温で15分間インキュベートします。PBS/1% FBSの10倍の量を追加します。200 x gおよびRTで5分間遠心分離します。
11. 必要に応じて、細胞懸濁液を4°Cで一晩インキュベートします。これが行われる場合は、細胞懸濁液チューブにPBS / 1%FBSではなく神経細胞培地を充填します。チューブを水平に置き、4°Cに保ちます。

3. 網膜細胞の免疫標識

1. 細胞数あたりの抗体の量を決定するには、次の変換を使用します:100 μLの容量中の5.0 x 10⁶細胞あたり2 μLの抗体
。
2. 細胞を洗浄し、PBS/1% FBSに維持します。ソート設定時にネガティブコントロール(非標識)として使用するセル(5.0 x 10⁶セル)の小さなアリコートを取ります。
   手記：このネガティブコントロールは、セルソーターの適切なキャリブレーションに不可欠です。
3. Fcγ受容体IIおよびIIIを発現する細胞への抗体の非特異的結合を最小限に抑えるには、PBS/1% FBSを使用して、最終容量50 μLに1.0 x 10⁶細胞あたり1 μLの抗マウスCD16/32抗体を添加します。室温で10分間インキュベートします。
4. 抗体カクテルをサンプルに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。アイスバケツで30分間インキュベートします。タグ付き蛍光色素の光退色により、光が実験を損なう可能性があるため、氷のバケツが覆われていることを確認してください。
   1. 次の蛍光タグ付き抗マウス抗体を使用して抗体カクテルを調製します:CD90.2 AF (Alexa fluor)-700、CD48 PE (Phycoerythrin)-Cyanine7、CD15 PE、およびタグなし CD57.
      注:各抗体について、5.0 x 10⁶細胞あたり次の濃度を使用してください:CD90.2 AF700、1 μg;CD48 PE-シアニン7、0.4μg;CD15 PE、0.02μg;タグなしCD57、0.4μg。
      1. 以下の計算に従って容量を使用します(材料表に記載されている市販の抗体に基づく): 標識する細胞の合計 5.0 x 10⁷ 個、5.0 x 10⁶ 細胞あたり 2 μL = 各抗体の 20 μL、4 種類の抗体 = 80 μL の抗体カクテル、最終容量 = [(5.0 x 10⁷ total cells)/5.0 x 10⁶細胞] x 100 = 1,000 μL;80 μL Abs + 50 μL 抗マウス CD16/32 + 870 μL PBS/1% FBS = 1,000 μL.
         手記：この組み合わせにより、装置構成に最適な蛍光色素の組み合わせが得られました。次のパラメータは、発光と励起を要約しています:AF-700、638 nmの赤色ダイオードレーザーで励起したときの719 nmの発光。PE-Cyanine7、488 nm青色ダイオードレーザーで励起した場合の767 nmの発光。PE、488nmの青色ダイオードレーザーで励起した場合の575nmの発光。
5. 30分間のインキュベーション後、PBS/1% FBSを使用して容量を最大5 mLにします。サンプルを200 x gおよびRTで7分間遠心分離して洗浄し、手順を一度繰り返して、結合していないすべての抗体を除去します。
6. 2 μLの二次抗体(0.1 μg)を添加すると、5.0 x 106細胞のCD57に結合します。ステップ3.4のように、アイスバケツで30分間インキュベートします。ステップ3.5のように、細胞を2回洗浄します。
   1. ステップ3.4.
      でタグなしの一次抗体を使用した場合は、二次抗体で細胞を標識します。 注:この構成に最適な二次抗体は、材料表に記載されています。発光波長は421nmです。405nmの紫色ダイオードレーザーで励起した場合、450/50nmのバンドパスフィルターで使用します。
   2. 以下の計算による使用量(材料表に記載されている市販の抗体に基づく):5.0 x 10⁶細胞あたり2 μL = 二次抗体20 μL、最終容量 = [(5.0 x 10⁷ total cells)/5.0 x 10⁶ cells] x 50 = 500 μL、Abs 20 μL + 480 μL PBS/1% FBS = 500 μL。
7. 標識されたセルはPBS/1% FBSに保管してください。血球計算盤を使用して細胞を数えます。最終的な網膜細胞濃度3.0 - 4.0 x 10⁷細胞/mL.
   手記：フェノールレッドは自家蛍光を増加させ、それによって陰性細胞と陽性細胞の間の分解能を低下させる可能性があるため、細胞を希釈するために細胞培養培地を使用しないでください。容量あたりの最終的な細胞濃度は、装置構成の体積流量に大きく依存します。
8. セットアップ中に単色コントロールを使用して、蛍光の波及を最小限に抑えます.
   手記：このステップは、コンペンセーションとも呼ばれ、蛍光色素の組み合わせによって生じるノイズを補正するために適用されます。PBS/0.1% BSA/2 mM NaN3 中のポリスチレンミクロスフェアは、複数の分子種由来の蛍光タグ付き免疫グロブリン(Ig)アイソタイプに結合する能力を持ち、コンペンセーションを設定するためのポジティブコントロールを提供します。
   1. ポリスチレンマイクロスフェアを3滴滅菌FACSチューブに入れ、フルオロフォアごとに1滴を割り当てます。各チューブにそれぞれ1 μgの蛍光色素を加えます。光から保護した室温で15分間インキュベートします。3 mLのPBS/1% FBSをサンプルチューブに加えます。200 x gおよびRTで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去し、250 μLのPBS/1% FBSに再懸濁します。
   2. ネガティブコントロールを設定するには、Igに結合しないポリスチレンマイクロスフェアを使用します。必要に応じて、この手順を前日に実行してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウスCD15 PE	バイオレジェンド	125606	クローンMC-480
抗マウスCD48 PE-Cy7	バイオレジェンド	103424	クローンHM48-1
抗マウスCD57	シグマ・アルドリッチ	C6680-100TST	クローンVC1.1
抗マウスCD90.2 AF700	バイオレジェンド	105320	クローン30-H12
ブリリアントバイオレット421ヤギ抗マウスIgG	バイオレジェンド	405317	クローンポリ4053
精製抗マウスCD16/32	バイオレジェンド	101302	FcgRII/IIIブロック、クローン93
ウシ胎児血清	ハイクロン	03 SH30071月	米国発祥
AbCトータル抗体コンペンセーションビーズキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A10497 (英語)	マルチスピーシーズ Ig
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	培養前に培地に血清を添加します。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010049	生理 食塩 水
解剖顕微鏡	オリンポス	SZ-PTモデル	実体顕微鏡
ソルバル遠心分離機	サーモサイエンティフィック	ST16R	すべての遠心分離はRTで行われます
ベースプレート–解剖パン	フィッシャーサイエンティフィック	SB15233FIM	ワックスプレートも使用できます
鉗子	エイスクラップ	5002-7	4 1/2インチ
アイリスハサミ、ストレート	エイスクラップ	1360	5 1/2インチ
Falcon 15 mLコニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352097	ポリプロピレンチューブ
Falcon 50 mL コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352098	ポリプロピレンチューブ
BD FACSチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352003	ポリプロピレンチューブ
40mm皿	ミッドサイ	TP93040	組織培養処理
70 μm ナイロンストレーナー	ミッドサイ	70ICSの	不妊
40 μm ナイロンストレーナー	ミッドサイ	40ICSの	不妊
BD 10 mLシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	301604	針なしの使い捨てシリンジ
乳棒	ミッドサイ	害虫	不妊
ウィートンバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	986734	ライナーなし
BD 30 G ニードル	フィッシャーサイエンティフィック	305128	1インチ
ハウサーサイエンティフィックブライトラインガラス計数チャンバー	フィッシャーサイエンティフィック	0267151Bさん	血球計算盤
Gibco トリパンブルー 0.4% 溶液	フィッシャーサイエンティフィック	15250061	生存率染料
エッペンドルフチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-402-25	1.5mL
EVOS Floid細胞イメージング	サーモフィッシャーサイエンティフィック	447113	20倍対物レンズによる蛍光イメージング
100%エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	04-355-452	70%エタノールの製造に使用
Pipet-Lite LTS ピペット L-1000XLS+	レイニン	17014282	LTSピペット
Pipet-Lite LTS ピペット L-200XLS+	レイニン	17014391	LTSピペット
Pipet-Lite LTS ピペット L-20XLS+	レイニン	17014392	LTSピペット
ラックLTS 1000 mL – GPS-L1000S	レイニン	17005088	ブルーラック滅菌チップ
ラックLTS 250 mL – GPS-L250S	レイニン	17005092	グリーンラック滅菌チップ
ラックLTS 20 mL – GPS-L10S	レイニン	17005090	レッドラック滅菌チップ
FACSAria II セルソーター	BDバイオサイエンス	該当なし	カスタムオーダー
LSR II サイトメーター	BDバイオサイエンス	該当なし	カスタムオーダー

の 年 (代表)