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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>注:簡単に説明すると、線維芽細胞はmRNAベースの遺伝子リプログラミングを介してiPS細胞に再プログラムされました。iPSCは幹細胞培地(SCM)(材料リストを参照)で維持し、1 mLのSCMで~1.2 x 102細胞/mL、10 μMでrho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCKi)Y-27632、および10%(v/v)ジメチルスルフィド(DMSO)の密度で、-160°Cの液体窒素中で凍結保存されたバイアルで保存しました。以下の手順はすべて、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで実行されます。
1. 基底膜マトリックス希釈とプレートコーティング
フェ- ノールレッドを含まないダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)のEngelbreth-Holm-Swarm腫瘍から精製された希釈(1:50)成長因子減少基底膜マトリックス。
- 細胞培養プレートに適量の希釈基底膜マトリックス(6ウェルプレート=1mL、12ウェルプレート=0.5mL)をコーティングし、これらのプレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベー
トします。
>2. 人工多能性幹細胞(iPSC)のメンテナンス
>注:6ウェル平底プレートのウェルあたりの最大コンフルエンシーは、~1.2 x 106セルです。
- 凍結保存したiPS細胞を10 μM Y-27632でSCMに解凍し、希釈成長因子低減基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレート上にプレート
化します。
- 融解後最初の24時間は、10 μM Y-27632のSCMでiPS細胞を維持します。24時間後に新鮮な媒体に切り替えます。
- 細胞が80〜90%のコンフルエントに達するまで、iPS細胞をSCMに保持してから継代します。
- 分化に必要なiPS細胞の数を計算するには、分化に必要な密度(15,600細胞/cm2)にウェルの表面積を掛けます。6ウェル平底プレートの場合、15,600細胞/cm2に9.6 cm2を掛けると、合計149,760細胞/ウェルになります。
- 継代するには、ハンクス平衡塩溶液(HBBS)で細胞を洗浄します。次に、細胞を非酵素的エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(材料リストを参照)と37°Cで5分間インキュベートします。
- セルスクレーパーを使用して、セルをそっと持ち上げます。新鮮なSCMで細胞を採取します。
- 希釈したSCMでコーティングした細胞培養プレートに細胞をプレート化し、ステップ2.3で説明したように細胞を維持するか、1 mLのSCM、10 μM Y-27632、および10% DMSO(v/v)に~1.2 x10 6細胞/mLで保存し、-160°Cの温度で液体窒素中に凍結保存したバイアルで
保存します。
>3. iPS細胞とBMECの区別
>注:非酵素的EDTAは細胞を塊に分離します。酵素EDTA(材料の表を参照)は、細胞を単一細胞懸濁液に分離します。レチノイン酸(RA)は光から保護する必要があります。
- iPSCsをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で一度洗浄します。酵素EDTA(6ウェルプレートの場合は1 mL、12ウェルプレートの場合は0.5 mL、24ウェルプレートの場合は0.25 mL)と37°Cで約5分間インキュベートすると、シングルセル懸濁液が得られます。
- 細胞を採取し、300 x g(相対遠心力)で室温で5分間遠心分離します。10 μM Y-27632を含むSCMに細胞ペレットを再懸濁します。
- Trypan Blueと自動セルカウンター、または血球計算盤装置を使用して細胞密度を測定します。10 μM Y-27632を含有するSCM中の6ウェル平底プレート(表面積9.6 cm2/ウェル)の密度15,600細胞/cm2または149,760細胞/ウェルのプレートセルを24時間。
- 24 時間後に SCM を E6 medium に変更して、微分を開始します。次の4日間、E6ミディアムを毎日変更します。
- 分化の 4 日目に、E6 培地を、希釈した (1:200) B27 サプリメント、20 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、および 10 μM RA を添加したヒト内皮無血清培地 (hESFM) に置き換えます。次の48時間は、この媒体を変更しないでください。
- 200 mLのhESFMを希釈(1:200)B27で調製し、1 mLの50倍濃縮B27サプリメントを199 mLのhESFMに混合します。
- 250 μL の Tris バッファー (5 mM Tris、pH 7.6、150 mMsodium chloride、NaCl) に 50 μg の bFGF を再溶解して 200 μg/mL の bFGF を調製し、200 μg/mL のストック溶液を調製します。200 μL の 200 μg/mL bFGF と 200 mL の hESFM を混合して、20 ng/mL bFGF を含む 200 mL の hESFM を調製します。
- まず、100 mgのRA粉末に2.5 mLのDMSOを添加して、40 mg/mLのRAストック溶液を調製し、10 μM RAを調製します。この濃度を3 mg/mLに希釈して、10 mMのストック溶液を作ります。200 mL の hESFM に 200 μL の 10μM RA を混合して、10 μM RA を含む 200 mL の hESFM を調製します。
4. iPS細胞由来BMECの精製のためのコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスのコーティング
- 2 mLの滅菌水2 mLを2 mgのFNに加えて、1 mg / mLのFNストック溶液を作ります。5 mLの滅菌水5 mLを5 mgのCOL4に加えて、1 mg / mLのCOL4ストック溶液を作ります。
- FNを37°Cで少なくとも30分間溶解させ、COL4を室温で溶解させます。
- FN原液を滅菌水で最終濃度100 μg/mLに希釈し、COL4原液を最終濃度400 μg/mLに希釈します。
- 目的のプレート(6ウェルプレート=1 mLのCOL4/FN溶液、12ウェルプレート=0.5 mL、24ウェルプレート=0.25 mL、12-トランズウェルフィルタープレート=0.25 mL)を、400 μg/mL COL4と100 μg/mL FNの混合物でコーティングします。
- プレートを最低 2 時間、または 37°C で一晩インキュベートします。Transwell フィルタープレートの場合は、最低 4 時間を推奨します。
5. iPS細胞由来BMECの継代培養と精製
>注:酵素EDTAとのインキュベーションは、分化6日目の細胞のコンフルエンシーによっては15分以上かかる場合があります。
- 分化の6日目に、細胞をDPBSで2回洗浄します。1 mLの酵素EDTAと37°Cで少なくとも15分間インキュベートし、単一細胞懸濁液が得られるまでインキュベートします。
- 300 x gで室温で5分間遠心分離し、細胞を回収します。希釈した(1:200)B27サプリメント、20 ng/mL bFGF、および10 μM RAを含む新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁します。
- 400 μg/mL COL4 と 100 μg/mL FN の混合物でコーティングしたプレート上のシード細胞を、6 ウェルプレートの 1 ウェルと 12 ウェルプレートの 3 ウェル、12 トランズウェルろ過プレートの 3 ウェル、または 24 ウェルプレートの 6 ウェルの比率でシード細胞
を調製します。