多電極アレイ上でのニワトリ胚性ニューロンの単離と培養

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マテリアルのセットアップ

1. 市販の卓上卵インキュベーターでひよこの卵を37°Cでインキュベートし、E7胚のために卵を7日間インキュベートします。
2. 多電極アレイ(MEA)を準備します。必要な数のMEAを70%エタノールに3〜4時間浸し、バイオセーフティレベルII(BSLII)フード内の約10mLの滅菌蒸留水で3回すすいで滅菌します><。 手記：MEAには、8 x 8グリッドに配置された64個のナノ多孔性白金電極が含まれています。電極径は30μm、電極間の間隔は200μmです。MEAの滅菌に変性エタノールを使用しないでください、これは腐食につながるからです。
3. MEAを蓋付きの滅菌容器に入れ(滅菌状態を維持するため)、卓上インキュベーターに移動します。55°Cで6時間以上焼きます。このステップは適切な滅菌にとって重要であり、温度は60°Cを超えてはなりません。無菌性を維持するために、MEAを含む皿をBSLIIフードに移動して、さらに使用するまで保管します。
   手記： プラスチックフタ付きのオーブン対応ガラス製グラタン皿を使用し、70%エタノールで表面殺菌し、BSLIIフードに入れて乾燥させます。
4. 細胞外マトリックス(ECM)溶液を分注します。バイアルを4°Cで一晩解凍し、100μLのアリコートを-20°Cで凍結します
   手記：ECMは冷凍状態で出荷されます。室温で重合し、重合するとコーティングできないため、コーティングの準備が整うまで室温に戻さないでください。成長因子を含まないECMは、未知の要因による追加の影響を防ぐために好まれます。
5. すべての解剖器具(デュモン#5鉗子、湾曲鉗子、小型はさみ、スプリングハサミ)とセルフシール材でコーティングされた解剖皿を70%エタノールで滅菌し、解剖フードで乾燥させます。

2. ひよこ胚性ニューロンの培養とネットワーク活動

1. めっき当日は、-20°Cの冷凍庫からECMのバイアルを取り出し、70%エタノールを噴霧して氷の上に置きます。BSLIIフード内に300μLの冷たい神経基礎培地を加えて25%に希釈します。
2. P200ピペットマンを使用して、電極に触れないように注意しながらMEAの中心に25%ECMを100μL加え、すぐに取り除きます。MEAを覆い、ニューロンをプレートする準備ができるまでCO₂インキュベーター(37°Cおよび5%CO₂)に置きます。
3. E7卵子(胚7日目、37°Cで7日間インキュベート)の外殻を70%エタノールで滅菌します。カルシウムを含まない冷たく滅菌されたハンクの平衡塩溶液(HBSS)を含むシルガード底解剖皿に胚を斬首します。目の周りを切り取り、眼球を取り除きます。DuMont #5の細い鉗子とスプリングハサミを使用して、腹側を切開し、皮膚の外層を取り除き、前脳と視蓋を露出させます。ピアルメンブレンを慎重に剥がして取り除きます。前脳を別のシャーレに移し、スプリングハサミで約2mmの小片に切ります
   手記：絨毛膜を切除した後、前脳に血管が付着してはいけません。可能であれば、滅菌解剖フードで解剖を行うことが望ましいですが、器具と解剖領域が70%エタノールで完全に滅菌されている限り、フードの外で解剖を行うとかなり良好な結果が得られています。
4. 滅菌トランスファーピペットを使用して、前脳の断片を15mLの遠心分離チューブに収集し、遠心分離チューブの底に沈めた後、HBSSをできるだけ多く除去します。
5. 0.05%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(トリプシン/EDTA)1 mL(37°Cに予熱)を加え、37°Cで15分間インキュベートします。
6. パスツールピペットを使用して、組織片を乱さずにトリプシンを慎重に除去し、1mLの神経基礎培地を追加します。ティッシュ片を底に沈め、培地を取り除きます。この洗浄をもう一度繰り返します。この手順は、トリプシン/ EDTAを洗い流すことです。
7. 2 mLのニューロベースル培地を加え、トリチュレーションを開始します。トリチュレーションでは、滅菌済みのファイヤーポリッシュされたパスツールピペットを手に取り、破片が見えなくなるまで組織を数回優しく通過させます。繰り返し通過した後にピースが残っている場合は、底に落ち着くまでそのままにしてください。
   手記： 粉砕中の泡立ては避けてください-泡が形成された場合は、吸引して停止して取り除きます。
8. 再懸濁した細胞を神経基礎培地で1:10に希釈し、Trypan Blue色素と血球計算盤を使用して生存細胞をカウントします。希釈した細胞50 μLを50 μLのトリパンブルー溶液と0.5 mLの遠心チューブで混合します。カバーガラスに貼った後、血球計算盤に10 μLを加え、明るく透明な細胞をカウントします(青色の細胞は死んでいるため、カウントしないでください).
   手記：単一のE7光学テクタムからの一般的な細胞数は、1〜5 x 10⁷細胞/mLの範囲です。
9. 分離した細胞をECMコーティングされたMEAに2,200細胞/平方mmの密度でプレートします。当社のMEAシステムでは、これはMEAあたり約130,000個の細胞に相当します。神経基礎培地を添加してMEA内の容量を1 mLにし、MEAをCO₂インキュベーターに一晩置いて細胞の接着と神経突起の伸長を行います(図1)
   手記：異なる領域と電極数のMEAについては、異なる細胞密度を試すことができます - 一般に、細胞密度が高いほどネットワーク活性が大きくなりますが、培養の寿命が短くなります。

図1:ニワトリの前脳の解剖から解離、プレーティング、ネットワーク活動の記録までのステップを示すプロトコルの概略図。