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1. iPS細胞由来神経前駆細胞(iNPC)の生成
- 以下に説明し、以前に発表したように、iPSCコロニーからEZスフィアを作製します。
- mTESR1またはその他の市販培地中の基底膜マトリックスコーティング6ウェルプレート(0.5 mg/プレート)上で、iPSCコロニーをコンフルエントに培養します(材料表を参照)。
- iPSC培地を取り出し、2 mLのEZ-sphere培地[ESM;DMEM:F12 7:3に100 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、100 ng/mLの上皮成長因子、5 μg/mLヘパリン、および2% B27サプリメントを添加。
- 滅菌済みの1000 μLピペットチップまたはセルスクレーパーの背面で、各コンフルエントウェルの底をこすり落とします。
- すべての細胞を採取し、超低付着T25フラスコに入れて、自由に浮遊する球体を自発的に形成できるようにします。37°Cで一晩インキュベートします。
- 培地が黄色に変わったら、培地の半分を新しいESMと交換して、2〜3日ごとに球体に給餌します。これにより、球体は調整された培地に留まることができ、これは球体の成長と維持にとって非常に重要です。
- フラスコをチューブラックに立てかけ、球体が重力によってフラスコの角まで1〜2分間沈殿するのを待ちます。
- 落ち着いたら、上清の半分を5 mLまたは10 mLの血清ピペットで吸引し、事前に温めた新鮮なESMと交換します。
- EZ球体は、前述のように球体を直径200μmに切り刻むことにより、毎週通過します。EZスフィアは最大25のパッセージで維持でき、パッセージ8〜25の間で使用するのに最適です。
- iNPCのシングルセル懸濁液を調製します。
- 神経分化を誘導するには、EZスフィアを単一細胞に解離します。
- チョッピング後3〜4日でT75フラスコから球体を採取し、15 mLの円錐形に移し、2分間またはすべての球体が底に落ち着くまで放置します。
- 5 mLピペットでESMをゆっくりと除去し、沈降した球体を乱さずにします。1 mLの解離溶液(材料表を参照)を加え、37°Cで10分間インキュベー
トします。
- 5分間のインキュベーション後に解離溶液と球体を渦巻かせ、沈降した球体が処理されることを確認します。
- 解離液をゆっくりと取り除きます。1 mLの神経分化培地[NDM;DMEM:F12に2%B27マイナスビタミンA、1%N2サプリメント、およびヒト脳由来神経栄養因子(hBDNF、20ng/mL)]。
- 1 mLピペットと200 μLピペットを使用してピペッティングし、すべての球体が解離するまで、球体を単一細胞に粉砕します。トリチュレーション手順中の気泡形成を避けてください。
- 血球計算盤を使用して解離した細胞をカウントし、細胞を最終密度1 x 106細胞/mLに希釈します。用途によって密度を変えることが可能です.
手記：3 日以内の短期培養には高い密度(最大 6 x10 6 細胞/mL)が推奨され、3 週間以内の長期培養には低密度の液が推奨されます。
手記： これで、細胞はチップの上部チャネルに播種して「脳側」を形成する準備が整いました。
2. iPS細胞のiBMECへの差別化
- 6ウェルプレートの1つのコンフルエントウェルから1:6の比率でiPS細胞を6ウェル基底膜マトリックスコーティングプレートに通過させます。細胞を24時間接着させます。iPSC培地は毎日交換してください。
- 血球計算盤を使用して毎日細胞をカウントします。
- 細胞の密度が1.5–3.0 x 105細胞/ウェルに達したら、iPSC培地をbFGFを含まない3 mLの無条件培地と交換します[DMEM:F12 1:1、10%ノックアウト血清置換(KOSR)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、0.5%グルタミンサプリメント(Table of Materials)、および100 μM β-メルカプトエタノール]。ミディアムを毎日6日間交換します。
- 6日目に、培地を内皮細胞(EC)培地[1%血小板欠血血漿由来ウシ血清、20 ng/mL bFGF、および10 μMオールトランスレチノイン酸(RA)]を補充したヒト内皮無血清培地(hESFM)と交換します。ミディアムを2日間放置します。
- EC培地を取り出し、ウェルあたり1 mLの解離溶液を加えます。37°Cで35分間インキュベートします.
手記：これは、ここで使用される解離溶液でのインキュベーション時間が長いと考えられていますが、iBMECは90%を超える細胞生存率でこの処理に耐えることができます。
- 細胞懸濁液を穏やかにピペッティングし、すべての細胞を15 mLの円錐管に集めて、細胞をウェルから分離します。
手記： 過酷なピペッティングは避けてください。細胞が容易に剥離しない場合は、さらに5分間インキュベー トします。
- 15 mLのコニカルに1容量のEC培地を加えてAccutaseを不活性化し、200 x gで5分間遠心分離し、培地を取り出して、1 mLのEC培地(bFGFおよびRAなし)と交換します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞密度を14–20 x 106細胞/mL><に調整します。
手記： これで、細胞をチップの下部チャネルに播種して「血液側」を形成する準備が整いました。
>3. 臓器チップの微細加工
- BBBチップモデルとその製造には、以前に行ったようにオルガンチップを使用します。背の高いチャネルオルガンチップ(材料の表を参照)は、柔軟性の高い多孔質膜によって分離された2つの重ね合わせられた平行なマイクロスケールチャネルを含む、柔軟性の高いポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーから製造されています。マイクロチャネルのサイズは、上部と下部がそれぞれ1 mm x 1 mmと1.0 mm x 0.2 mmです。2つのチャネルは、厚さ50 μmのPDMS製フレキシブル多孔質膜によって分離されており、直径7 μm、間隔40 μmの細孔が含まれています。チャネルを分離する多孔質膜の表面積は0.171cm2です。
4. チップの準備
- 臓器チップはチップキャリア内にあらかじめパッケージ化されて供給されるため、取り扱い中にチップのアライメントを乱したり歪めたりする必要がありません。さらに、チップキャリアは、培養モジュールとチップの間のインターフェースとして機能するポータブルモジュール(「ポッド」)にしっかりと接続されます。
- チップのパッケージに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネット(BSC)に入れます。
- パッケージを開けて、臓器チップを滅菌済みのペトリ皿に広げます。チップキャリアは、チップに直接触れないように、側面でのみ取り扱ってください。
- キャリアのタブが右を向いていることを確認し(図1)、複数のチップを使用する場合は、すべてのチップを同じ方向に合わせます。
- キャリアタブで各チップにラベルを付けます(完全なチップ調製とワークフローを図2に示します)。
5. 表面活性化とECMコーティング
- 表面活性化液の調製
- エミュレート試薬1(ER-1)は、5 mgのバイアルに入っており、光感受性があります。使用直前に新しいER-1溶液を調製してください。ER-1の完全性は、チップの調製を成功させるために重要です。
- ER-1.
を取り扱う際はBSCのライトを消してください
手記： ER-1は眼刺激性物質であり、適切な手袋と目の保護具を使用してBSCで取り扱う必要があります。
- ER-1およびER-2試薬を室温(RT)まで平衡化してから使用してください。
- 空の滅菌15 mLコニカルチューブをホイルで包み、溶液を光から保護します。
- BSCで、ER-1バイアルを軽くたたいて、粉末を底に沈めます。
- 1 mLのER-2バッファーをバイアルに加え、すぐにその内容物を15 mLの包み込みコニカルチューブの底に移します。ピペットで混ぜないでください。円錐管に移された溶液の色は赤になります。
- 手順5.1.6を3回繰り返します。最後のラウンドでは、ER-1バイアルをキャップし、反転させて蓋から残りの粉末を収集し、溶液を円錐形のチューブに移します。これにより、ER-1溶液の総容量は4mLになります。
- 15 mLコニカルチューブ内の4 mLのER-1溶液に6 mLのER-2溶液を加えて、最終濃度を0.5 mg / mLにします。.ER-1はER-2溶液内に完全に溶解する必要があります。
- サーフェスの活性化
- P200ピペットと滅菌済み200μLフィルター付きピペットチップを使用して、200μLのER-1混合物を吸い取ります。
- ピペットを下部のインレットに置き、混合物が下部のチャネル出口から流れ始めるまで、20 μLのER-1混合物を下部チャネルに押し込みます。
- 約50 μLのER-1混合物を加え、上部チャネルインレットに入れます。混合物が上部チャネル出口から流れ出始めるまで、混合物を上部チャネルに押し込みます。
- 穏やかな吸引により、チップの表面から余分なER-1混合物をすべて取り除きます。ER-1混合物がチップ表面からのみ除去され、チャネルからは除去されないことを確認してください。
- 紫外線(UV)を活性化する前に、チャネルに気泡がないことを確認してください。気泡が検出された場合は、ER-1混合物でチャネルを洗浄して気泡を取り除きます。
- チップが入った開いた皿をUVライトボックス(Emulate社提供)に入れます。
- UVライトボックスの背面にあるスイッチを「一貫性」に設定します。電源を入れ、UVアクティベーションを開始します。チップをUVライトの下に20分間置いておきます.
手記： 人員が紫外線にさらされないようにしてください。
- 両方のチャネルからER-1混合物を取り出します。
- 各チャネルを200μLのER-2溶液で洗浄します。
- 両方のチャネルからER-2を取り外します。
- 各チャネルを200 μLの滅菌冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄します。
- 次のステップに進むまで、チャネル内にコールドDPBSを残しておきます。
- 細胞外マトリックス(ECM)の調製とコーティング
- 個々のECM成分を冷たいDPBS、水、またはその他の溶媒と組み合わせて、最終的な作業濃度までECM溶液を調製します。ECM溶液は、使用するたびに新鮮に調製する必要があります。
- チップの上部と下部の両方のチャネルをECMでコーティングし、播種する細胞タイプによって決定される組成でコーティングします。ECM混合物は、使用するまで氷上で保持する必要があります。
- ラミニン(50 μg/mL)を使用して「脳側」をコーティングし、コラーゲンIVとフィブロネクチンを4:1の比率(320:80 μg/mL)で混合して、セクション5.6で説明したように「血液側」をコーティングします。
- ECMアリコートの調製
- 1 mg/mL ラミニンを冷 DPBS で希釈し、最終濃度を 50 μg/mL にします。アリコートし、使用するまで-20°Cで保存します。
- コラーゲンIVを0.1%酢酸に1 mg / mLの濃度で溶解します。.溶液を2〜8°Cで一晩、または室温で1〜3時間、または完全に溶解するまでインキュベー
トします。
- コラーゲンIV:フィブロネクチン(コラーゲンIV320μL、フィブロネクチン80μL、滅菌二重蒸留H2O600μL)の混合物1mLを調製します。混合物は-20°Cで保存できます。
- ECMによるチップのコーティング
- 両方のチャネルからコールドDPBSを完全に吸引します。P200ピペットにセットして、100 μLのコラーゲンIV:フィブロネクチン溶液を取り込むようにします。
- 出口に小さな液滴が形成されるまで、下部チャネル入口から溶液を導入します。ピペットチップを取り外した後、インレットに小さな液滴を残します。
- 上部チャネル入口からラミニン溶液を、出口に小さな液滴が形成されるまで導入します。ピペットチップを取り外した後、インレットに小さな液滴を残します。
- チャネルをよく見て、気泡が存在しないことを確認します。気泡が存在する場合は、すべての気泡が除去されるまで、適切なECM溶液でチャネルを洗浄します。
- 各チップについて、手順5.5.1〜5.5.4を繰り返します。
- 15 mLコニカルチューブのキャップに1.5 mLのDPBSを加えます。DPBSキャップをチップと一緒に150mmの培養皿に入れて湿度を高め、皿をパラフィルムで密封します。最良の結果を得るには、チップを4°Cで一晩インキュベートします.
手記：必要に応じて、チップの活性化とECMコーティングと同じ日に細胞を播種することができますが、一晩のインキュベーションが好ましいです。チップは、ECMを添加し、チップを37°Cでインキュベートしてから4時間後に播種する準備が整います。
6. 「脳側」チャネルの播種とEZ球体の混合神経培養への分化
- 準備したチップスが入った皿をBSCに持って行きます。両方のチャンネルを200 μLのNDMで穏やかに洗浄します。
- ポートとの接触を避けて、チップの表面から余分なメディア液滴を慎重に吸引します。各チップを播種する前に細胞懸濁液を穏やかに攪拌して、均一な細胞懸濁液を確保します
- iNPCをトップチャンネルにシードして「ブレインサイド」を生成する
- 細胞(1 x 106細胞/mL)をチップの上部チャネルに播種します。30〜100 μLの細胞懸濁液を含むP200チップを上部チャネルインレットに加え、チップをピペットから静かに放出します。空のP200ピペットを取り、プランジャーを押し下げて上部のチャネル出口に挿入し、シングルセル懸濁液をチップに慎重に引き出します。
- 皿を覆い、顕微鏡に移して、トップチャネル内の細胞の播種密度と均質な分布を確認します。ピペットチップをチップの入口ポートと出口ポートからそっと取り外します。
- 播種密度は 20% のカバレッジとして表示される必要があります。播種密度が予想よりも高いか低いか不均一な場合は、チップをBSCに戻し、200μLの新鮮な培地でチャネルを2回洗浄し、手順6.3.1を繰り返します。
- 正しい細胞密度を確認したら、チップの各バッチを播種した後、すぐにチップをインキュベーターに37°Cで2時間置きます。付着していない細胞は新しいNDMで洗い流します。
- 細胞を37°Cの静止状態に保ち、毎日NDMを少なくとも48時間交換してからフローを開始します。iBMECは、iNPCが付着した後、またはiNPCシーディングの翌日に播種することができます。
7. iBMECをボトムチャネルに播種して「血液側」を生成する
- 準備したチップスが入った皿をBSCに持って行きます。ボトムチャネルを200μLのECメディウムで優しく洗浄します。
- ポートとの接触を避け、チップの表面から余分なEC培地の液滴を慎重に吸引し、両方のチャネルに培地を残すようにします。各チップを播種する前に細胞懸濁液を穏やかに攪拌して、均一な細胞懸濁液を確保します。
- P200ピペットを使用して、30〜100 μLのiBMEC細胞懸濁液(14〜20 x 106細胞/mL)を吸い上げ、チップを下部チャネルインレットに入れます。チップをピペットからそっと外し、細胞を含むチップをインレットポートに残します。
- 先端が空のP200ピペットでプランジャーを押し下げ、下部チャネル出口に挿入し、ピペットプランジャーをゆっくりと解放して、単一セル懸濁液を下部チャネルから慎重に引き出します。
- チップの表面から余分な細胞懸濁液を吸引します。入口ポートと出口ポートに直接接触しないようにして、セル懸濁液がチャネルから吸引されないようにしてください。
- チップを覆い、顕微鏡に移して播種密度を観察します。下部のチャネルは、顕微鏡で4倍または10倍で観察した場合、細胞間に観察可能なギャップがないように埋める必要があります(図3)。
- 播種密度が90%未満のカバレッジまたは不均一に分布している場合は、それに応じて細胞密度を調整し、チャネル内で正しい密度が得られるまで手順7.2〜7.6を繰り返します。正しい細胞密度を確認した後(図3)、残りのチップに細胞を播種します。下部チャネルの上部にある多孔質膜に細胞を付着させるには、各チップを反転させ、チップクレードルで休ませます。
- 150 mmディッシュ内に小さなリザーバー(滅菌DPBSを含む15 mLの円錐チューブキャップ)を配置して、細胞に湿度を供給します。チップを37°Cで約3時間、またはボトムチャネルの細胞が付着するまでインキュベートします。iBMECが付着したら(播種後~3時間後)、チップを直立位置に戻し、細胞がボトムチャネルの底部に付着できるようにします。
8. フローの開始
- フローは通常、iBMECの播種後48時間で開始されます。この時間は、iBMECがチップにしっかりと取り付けられるために必要です。
- チップ内の層流を維持するためには、媒体の温度を脱気して平衡化することが重要です。培地は、37°Cのウォーターバスで1時間予温する必要があります。
- 加温した培地は、真空駆動ろ過システム下で15分間インキュベートすることにより、最大50 mLの脱気が可能です。
- ポータブルモジュールのプライミング
- ポータブルモジュールのパッケージとトレイの外側を70%エタノールで消毒し、拭いてBSCに移します。パッケージを開き、モジュールをトレイに入れます。リザーバーをトレイの後ろに向けて向き
を変えます。
- 3 mLの予め平衡化した温かい培地を各インレットリザーバーにピペットで移します。EC培地をボトムチャネルのインレットリザーバーに、NDMをトップチャネルの上部チャネルインレットリザーバーに加えます(図4)。
- 300 μLの予め平衡化された温かい培地を各出口リザーバーにピペットで、各出口ポートの真上に取り付けます(図4)。
- 各トレイに最大6つのポータブルモジュールを配置します。トレイをインキュベーターに持って行き、トレイハンドルを外側に向けて培養モジュールに完全にスライドさせます。
- 培養モジュールで「Prime」サイクルを選択して実行します。インキュベーターのドアを閉め、培養モジュールがポータブルモジュールをプライミングするのを待ちます(~1分かかります)。プライミングサイクルは、ステータスバーが「準備完了」と表示されたときに完了します。培養モジュールからトレイを取り外し、BSCに持って行きます。
- BSC の各ポータブル モジュールの底面を検査して、ポータブル モジュールが正常にプライミングされたことを確認します。4つのポートすべてに小さな液滴が存在するかどうかを確認します。
- ドロップレットが示されないポータブル モジュールがある場合は、それらのモジュールでプライム サイクルを再実行します。メディアがトレイに滴り落ちた場合(これは出口ポートによってより頻繁に発生する可能性があります)、70%エタノールでトレイを清掃します。
- ポータブルモジュールへのチップの接続、調整、およびフローの開始
- 各チップの両方のチャネルを、温かく平衡化した細胞特異的培養培地で穏やかに洗浄し、チャネル内の気泡の可能性をすべて除去し、各入口と出口ポートの上部に培地の小さな液滴(チャネル内の培地に応じて)を置きます。
- キャリア付きのチップをポータブルモジュールに挿入し、各トレイに最大6個ずつ配置します。トレイを培養モジュールに挿入します。培養モジュールで適切な臓器チップ培養条件(流量と伸び)をプログラムします。
- プログラムされた条件は、「調整」サイクルが完了するとすぐに開始されます.
手記：各チャンネルの流量は個別に制御でき、0〜1,000μL/hの範囲に設定できます。BBBチップは通常、30 μL/hで培養されます。EC媒体やESMなどの媒体を30 μL/hおよび1000 μL/hで流動させる場合、せん断力はそれぞれ0.01 dyn/cm2および0.33 dyn/cm2です。
- 約2時間かかる「Regulate」サイクルを実行し、その後、事前に設定された臓器チップ培養条件で培養モジュールの流れを開始します。
