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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. 背外側終脳マイクロダイセクション
- 解剖培地(100 mL)を準備します:98.5 mLハンクス平衡塩溶液(HBSS)、0.5 mL 5 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)pH 7.4、1 mLペニシリン/ストレプトマイシン(10,000ユニット/ mLおよび10,000 μg / mL)。
- 解剖媒体をフィルター滅菌します。
- イソフルランによる麻酔下で、妊娠中のマウスC57/Bl6(Mus musculus)から胚14日目(E14)の胚を取り出します
手記：E0は膣栓検出の日と考えてください。解剖は、妊娠中のマウスから取り外してから1時間以内に完了する必要があります。.このプロトコルは、胚E11〜E17にも適用されます。
- 無菌条件下で子宮摘出術により胚を摘出します。
- 胚を冷解剖培地(4°C)を入れたシャーレに移します。
- 縦方向の亀裂に沿って切断することにより、頭蓋骨から脳を取り出します。胚の数は通常5から10までさまざまです。各E14脳は、前駆細胞および有糸分裂後ニューロンを含む約2 x 106細胞を産生する(1:1の比率)
手記：実体顕微鏡を使用して、次の手順を行います。
- 解剖鉗子を使用して髄膜を取り除きます。中央で終脳を分割して、半球を分離します。背外側終脳を分離するには、解剖鉗子を使用して背内側曲線と陰璃体-陰璃下境界に沿って切断します。背外側終脳を冷解剖培地(4°C)を入れた2mLチューブに移し、すべての脳が解剖されるまで待ちます。
2. 細胞の解離とめっき
- 増殖培地(50 mLのDMEM + 10%FCS)を準備します:44 mLのダルベッコ修飾イーグルス培地(DMEM)、5 mLの子牛胎児血清(FCS)、0.5 mL 40%グルコース、0.5 mLペニシリン/ストレプトマイシン(10,000ユニット/ mLおよび10,000 μg / mL)。.増殖培地をフィルター滅菌します。
- 分化培地(DMEM50 mL + 2% B27):DMEM48 mL、B27 1 mL、40%グルコース0.5 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン0.5 mL(10,000 units/mL and 10,000 μg/mL)を調製します。分化培地をフィルター滅菌します。
- E14マウスから背外側終脳を顕微解剖した後、採取した組織と冷解剖培地(4°Cで5分間、340 x g)でチューブを遠心分離し、組織を沈殿させます。
- ピペットで上清を取り除き、予熱した(37°C)トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.05%)1 mLを加えて化学消化します。37°Cで15分間インキュベートし、2 mLの増殖培地を加えてトリプシン活性を停止させます。
- ガラス製のパスツールピペットの先端をガスバーナーまたはブンゼンバーナーで数秒間研磨して、絞りを少し狭めます。FCSを吸引してピペットを洗浄し、チップをコーティングします。気泡を避けるために、ファイヤーポリッシュおよびFCSコーティングされたパスツールピペットで細胞を機械的に解離します。
- 細胞を遠心分離します(4°Cで5分間、340 x g)。ピペットで上清を取り除きます。1 mLの増殖培地を加え、ピペットを使用して細胞を再懸濁します。この手順を一度繰り返します。
- 0.4% Trypan Blue溶液を使用して、細胞懸濁液を1:1に希釈して調製します。生存不能な細胞は青色になります。ノイバウアーチャンバーを使用して、生細胞(未染色)の数をカウントします。
- 細胞を増殖培地で希釈して、106細胞/mLを得ます。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに500 μLの細胞懸濁液(約2.5 × 105細胞/cm2)を加えます。細胞を37°Cおよび5%CO2.
でインキュベートします。
手記： ガラス製のカバースリップは、実験中に移動して観察範囲を変える可能性があるため、使用しないでください。あるいは、ガラス底組織培養プレートを使用してください.
手記：細胞培養処理されたマルチディッシュを使用していない場合は、プレートをPoly-D-Lysin(50 μg/ml)で37°Cで2時間前処理することが重要です。