マウス中脳初代ニューロンへの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスへの感染

要約

出典: Bancroft, E. A., et al., Quantifying Spontaneous Ca²⁺ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオは、蛍光カルシウムインジケーターを持つアデノ随伴ウイルスにマウスの中脳初代ニューロンを感染させる様子を示しています。インジケーターの蛍光は感染の成功を確認し、ニューロン感染のリアルタイムモニタリングを可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>注:細胞培養溶液は、生物学的安全キャビネット内で無菌手順を使用して調製し、汚染を防ぐために0.2μmでろ過する必要があります。

1. 溶液と培地の調製

1. 20 μLの1 mg/mLラミニンストックを2 mLの滅菌蒸留H₂Oに希釈してラミニンコーティング溶液を調製します。
2. 10%ウマ(ウマ)血清(ES)ストップ溶液を調製するには、5 mLのESを1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)の45 mLに加えます。.0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。
3. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に2 gのBSA粉末を加え、最終容量を45 mLにすることで、4%ウシ血清アルブミン(BSA)原液を調製します。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。
4. パパインを1x HBSSで3 mg / mLに希釈して、パパインストック溶液を調製します。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィ....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10X NA 0.3 水浸対物レンズ	オリンポス	UMPLFLN10XW
12mm円形カバーガラスNo.1	フェニックス研究製品	MS20-121
20X NA 0.85油浸対物レンズ	オリンポス	UPLSAPO20XO
35 mmコーティングされていないプラスチック細胞培養ディッシュ	VWRの	25382-348
40X NA 0.3 水浸対物レンズ	オリンポス	LUMPLFLN40XW
60X NA 1.35油浸対物レンズ	オリンポス	UPLSAPO60XO
アンピシリン(ナトリウム)	ゴールドバイオ	A-301-25
B-27サプリメント	サーモフィッシャー	17504044	50倍ストック
双眼顕微鏡	ケントサイエンティフィック	KSCXTS-1121
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7030
塩化カルシウム(CaCl2)、無水	シグマ・アルドリッチ	746495
デオキシリボヌクレアーゼI(DNase)	シグマ・アルドリッチ	DN25
D-グルコース、両性	シグマ・アルドリッチ	RDD016
DMEM + GlutaMAX ミディアム	サーモフィッシャー	10569010	500ミリリットル
馬の血清	サーモフィッシャー	26050088	ヒート不活性化
光ファイバーイルミネーター、100V	ケントサイエンティフィック	KSC5410
フィルターシステム、PES 22UM 250ML	VWRの	28199-764
Fluoview 1000共焦点顕微鏡	オリンポス
Fluoview 1200共焦点顕微鏡	オリンポス
GlutaMAXサプリメント	サーモフィッシャー	35050061
ハンクスバランス塩溶液(HBSS)1x	サーモフィッシャー	14175095	500ミリリットル
ヘープス	VWRの	101170から478
HeraCell 150 CO2インキュベーター	ヘレウス社(サーモフィッシャー社)
イメージJ v1.52e	NIHの
アイリス-ファインハサミ(丸型)-S / S Str / 31 * 8mm / 13cm	RWDの	S12014-13
カナマイシン一硫酸塩	ゴールドバイオ	品番: K-120-25
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020
L-アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A7506の
L-グルタミン酸	VWRの	97061-634
塩化マグネシウム(MgCl2)、および硬質	シグマ・アルドリッチ	M8266
MPII ミニ蠕動ポンプ、115/230 VAC、50/60 Hz	ハーバード大学装置	70-2027
ミュラーマイクロ鉗子-Str、0.15mmチップ、11cm	RWDの	F11014-11
NBQXの	こんにちはバイオ	HB0443
神経基礎媒体	サーモフィッシャー	21103049	500ミリリットル
正常なヤギ血清(NGS)	アブカム	AB7481
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	アドジーン	100837-AAV1	力価:1.00E + 13 gc / ml
パパイン	ワージントン・バイオメディカル・コーポレーション	LS003126
ペニシリンストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	10,000 U/mL
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x	サーモフィッシャー	10010049	500ミリリットル
ポリ-L-リジン	シグマ・アルドリッチ	P4832
ポリ-L-オルニチン	シグマ・アルドリッチ	P4957
塩化カリウム(KCl)、無水	シグマ・アルドリッチ	746436
MPII用ポンプヘッドチューブピース	ハーバード大学装置	〒55-4148
塩化ナトリウム(NaCl)、無水	シグマ・アルドリッチ	746398
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S7903	BioXtra、≥99.5%(GC)
妊娠雌C57BL/6マウス	テキサスA&Mゲノム医学研究所
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X100	500ミリリットル
ワイドボアブルーピペットチップP1000	VWRの	83007-380

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