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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>注:細胞培養溶液は、生物学的安全キャビネット内で無菌手順を使用して調製し、汚染を防ぐために0.2μmでろ過する必要があります。
1. 溶液と培地の調製
- 20 μLの1 mg/mLラミニンストックを2 mLの滅菌蒸留H2Oに希釈してラミニンコーティング溶液を調製します。
- 10%ウマ(ウマ)血清(ES)ストップ溶液を調製するには、5 mLのESを1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)の45 mLに加えます。.0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に2 gのBSA粉末を加え、最終容量を45 mLにすることで、4%ウシ血清アルブミン(BSA)原液を調製します。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。
- パパインを1x HBSSで3 mg / mLに希釈して、パパインストック溶液を調製します。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。-20°Cで保存してください。
- デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)溶液を調製するには、滅菌したH2Oに20 mgのDNase粉末を加え、最終容量を20 mLにします。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。-20°Cで保存してください。
- 無菌蒸留H2Oに352 mgのアスコルビン酸を加え、最終容量を20 mLにすることにより、アスコルビン酸ストック溶液を調製します。必要に応じて、37°Cの浴槽で加熱して溶解します。0.2 μmフィルターシステムまたはシリンジフィルターチップを使用した滅菌フィルター。-20°Cで保存してください。
- 50 mLのNeurobasal mediumに、Glutamax(100x)500 μL、ウマ血清500 μL、B-27 1 mL、アスコルビン酸100 μL、ペニシリン-ストレプトマイシン500 μL、カナマイシン50 μL、アンピシリン50 μLを添加して、細胞培養培地を調製します。0.2μmフィルターシステムを使用した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。
- 1x PBSの9 mLにTriton X-100 1 mLを加えて0.01% Triton X-100溶液を調製し、10%溶液を調製します。Triton X-100は粘性があるため、ゆっくりとピペットでチップが完全に満たされるようにします。37°Cの浴中で加熱し、必要に応じて溶解します。4°Cで保存してください。
- 10% Triton X-100 ストックを 0.01% に希釈するには、1:10 の連続希釈を 3 回行います。10%ストック1mLを1x PBS9 mLに希釈して1%溶液を調製します。1 mLの1%溶液を9 mLの1x PBSに希釈して、0.1%溶液を作ります。0.1%溶液1 mLを1x PBS9 mLに希釈して、0.01%溶液を作ります。
- 10%溶液として10%溶液として9mLの1x PBSに1mLのNGSを添加し、1x PBS9.9mLに100μLのNGSを加えて1%溶液を調製して1%溶液を調製します。
- 無菌蒸留H2Oに735 mgのL(+)-グルタミン酸を加え、最終容量50 mLにして、グルタミン酸ストック溶液(100 mM)を調製します。この濃度での溶解性が問題になります。少量(100 μL)の1 M塩酸を添加するだけで、溶解性が向上します。
- 無菌蒸留H2Oに50 mgのNBQXを加え、最終容量を13 mLにすることで、NBQXストック溶液(10 mM)を調製します。
2. 培養皿とカバースリップの準備(解剖前日に行う)
>注:ポリ-L-リジン、ポリ-L-オルニチン、ラミニンの3つのコーティング剤を組み合わせることで、理想的な細胞接着と生存率が得られることがわかりました。
- 10 35mmのペトリ皿を生物学的安全キャビネットに入れます。各ディッシュに2枚の円形12 mmカバースリップを置き、70% EtOHを10分間充填します。真空ラインを使用して各皿から残りのEtOHを吸引し、EtOHを完全に蒸発させます。
- 0.1%ポリ-L-リジン溶液を~90-100 μLで各カバースリップにピペットで塗布し、カバースリップ全体が覆われていることを確認します。皿に蓋をして、37°Cのインキュベーターに1時間置きます。
- 各カバーガラスから残りのポリ-L-リジン溶液を吸引し、滅菌済みのH2Oですすいでください。
- 0.1%ポリ-L-オルニチン溶液で手順2.2〜2.3を繰り返します。
- 再度、0.01%ラミニン溶液で手順2.2〜2.3を繰り返します。翌日の細胞プレーティングの準備が整うまで、37°C/5%CO2インキュベーターに置きます。
>3. マウス胚の解剖
>注:私たちは、培養ごとに4〜6匹の時限妊娠マウスを使用します。解剖プロセスの多くは生物学的安全キャビネットの外で行われますが、無菌手順を維持することは依然として重要です。解剖顕微鏡の近くの表面や手術器具に70%EtOHを豊富に使用することが理想的です。また、解剖時にはマスクを着用することで、汚染をさらに防ぐことができます。また、培地には4種類の抗生物質を使用しているため、コンタミネーションの可能性は低いです。ただし、抗生物質の使用に問題がある場合は、この解剖セットアップを滅菌フード内に移動させることができます。細胞生存率を維持するために、すべての解剖液を4°Cで予冷し、できるだけ早く解剖を完了する必要があります。氷上での解剖は行っておりません。マウス胚性中脳ニューロンの解剖方法は、前述の方法と同一です。
- 解剖顕微鏡の近くのベンチに吸収性パッド付きのスペースを用意し、70%EtOHをたっぷりとスプレーします。
- 100 x 15 mmガラス製ペトリ皿2枚と50 x 10 mmガラス製ペトリ皿1枚に70%EtOHを噴霧し、EtOHを蒸発させます。蒸発したら、滅菌済みの1x HBSS50 mLを各100 x 15 mmシャーレに入れます。
- 手術用ハサミ、鉗子、ミクロトームブレードを70%EtOHに最低10分間浸して滅菌します。吸収パッドに器具を置き、乾燥させます。
- CO2とそれに続く子宮頸部脱臼を使用して、胚14日目に生後2〜3か月の時限妊娠マウスを安楽死させます。
- 安楽死させたマウスの腹部に70%EtOHをスプレーします。鉗子を使用して下腹部をつかみ、手術用ハサミを使用して腹腔を開きます。鉗子が腹部を保持している場所の近くで切断を開始し、腹壁を折り返して子宮がはっきりと見えるまで、両側に横方向の切り込みを入れます。
- 手術用ハサミを使用して、子宮角の両端を切ります。次に、子宮を取り出し、1x HBSSを入れたシャーレに入れます。
- ストレートチップの鉗子を使用して、子宮から胚を慎重に取り出します。このプロセス全体を通してHBSSに胚を残します。鉗子またはミクロトームブレードのいずれかを使用して、首の近くを切って胚をすばやく切断します。できるだけレベルをカットします。
- 解剖顕微鏡で、胚の頭部を乾燥した50mmのシャーレに移し、腹側に置きます。鉗子で目/鼻の近くに配置して貫通することにより、頭を安定させます。鉗子は、中脳を貫通しないように、~45° で下向きに角度を付ける必要があります。
- 一方、鉗子を使用して、中脳の顕著な隆起の直前の皮膚と頭蓋骨の半透明の層を慎重に取り除きます。正中線近くから始めて、中脳が完全に露出するまで皮膚と頭蓋骨を尾側に取り除きます。
- 鉗子を露出した中脳に対して垂直に保持し、一方の先端を皮質と中脳の間に、もう一方の先端を小脳の近くに置きます。鉗子を押し下げてつまんで、中脳全体を切除します。中脳セグメントの厚さは約0.5mmである必要があります。中脳セグメントを、新鮮な1x HBSSで満たされた2番目のシャーレに入れます。このプロセスを各胚に対して繰り返します。
- 解剖顕微鏡を使用して、腹側を上にして脳セグメントを配置します。髄膜がまだ付着している場合は、鉗子でつかみ、持ち上げて脳セグメントから離して慎重に取り除きます。
- 脳セグメントには、4つの目に見える象限が必要です。2 つの小さい象限が 2 つの大きい象限よりも上に配置されるようにセグメントを配置します。上位の 2 つの (小さな) 象限と下位の 2 つの (大きな) 象限を分ける顕著な尾根があります。
- 鉗子を使用して、上位の象限をつまんで下象限から分離し、上位象限を破棄します。残りの下象限は、背側に横方向に過剰な組織を持ち、この組織は残りの腹側組織よりも不透明に見えます。密度の低い背側組織を取り除き、廃棄します。残りのセグメントには、Substantia nigra pars compacta(SNc)と腹側被蓋領域(VTA)の両方が含まれている必要があります。
- 鉗子を使用して、残りの腹側組織セグメントを4つの小さな断片に切断し、1mLのワイドボアピペットを使用して、これらのセグメントを1x HBSSの15mLコニカルチューブに移します。手順全体を通して、脳セグメントを備えた円錐管を氷の上に保ちます。
- 残りのすべての脳セグメントについて、このプロセスを繰り返します。
>4. 細胞の解離
- 細胞の酵素的消化
- 中脳セグメントを含む15mLの円錐形チューブからHBSSを慎重に吸引し、セグメントをチューブの底に残します。
- ~800 μLのパパイン溶液をチューブに加え、37 °Cのインキュベーターに7分間入れ、チューブをフリックして細胞を再懸濁し、さらに7 °Cのインキュベーターと交換します。
- ワイドボアの1 mLピペットチップを使用して、中脳セグメントのみを1 mLのDNaseアリコートに取り出します。セグメントがアリコートの底に達するか、約1分間の露出を待ちます。
- ワイドボアの1 mLピペットチップを使用して、中脳セグメントのみを2 mLのストップ溶液を含む15 mLコニカルチューブに取り出します。セグメントがチューブの底に沈殿するのを待ち、ストップ溶液で満たされた追加の円錐形チューブですすぎを繰り返します。
- 細胞懸濁液の機械的トリチュレーション
- 2回目の停止では、溶液リンスチューブを、幅広の1 mLピペットチップを使用して、大きな組織セグメントが見えなくなるまで細胞を10回上下にピペットします。細胞溶解を最小限に抑えるためには、過剰摂取を避けることが重要です。
- 4% BSA溶液300 μLを、脳セグメントを含む15 mLコニカルチューブの底にゆっくりとピペットで移します。ピペットチップを慎重に取り外して、サスペンション層を維持します。0.4 x gで3分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、細胞を400 μLの細胞培養培地に再懸濁します。
5. セルのめっき
>注: 経験に基づいて、胚ごとに約 100,000 個の生存細胞が収集されます。生後 2-3 か月の時限妊娠マウスは、通常 8-10 個の胚の同腹児数を持っています。したがって、時限妊娠マウスあたりの細胞の総収量の概算は、約 100 万個です。
- 血球計算盤を使用して細胞数を計数し、細胞培養培地を使用して懸濁液を2,000細胞/μLに希釈します。短く三つ折りにして混ぜます。
- ステップ2のラミニン溶液を含むカバーガラスをインキュベーターから取り外し、コーティングされたカバーガラスから残りのラミニン溶液を真空で吸引します。カバースリップが完全に乾かないように、すばやくプレートします。各カバースリップに100 μL(2.0 x 105細胞/カバースリップ)をピペットで移し、ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに1時間入れます。
- 各ディッシュに3 mLの細胞培養培地を慎重に加え、37°Cインキュベーターに戻します。ハーフミディアムの変更を週に2回、2週間行います。
6. アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる14 DIVでの細胞培養の感染
- 各ディッシュについて、1 mLの無血清DMEM培地と1 μLのhSyn-GCaMP6f AAV(1.0 x10 13力価)を調製します。
- 各ディッシュから細胞培養培地を吸引し、hSyn-GCaMP6fを含む無血清DMEM1 mLと交換します。その後、ディッシュを37°Cのインキュベーターに1時間戻します。
- AAVを含む無血清培地を吸引し、3 mLの細胞培養培地と交換します。ディッシュを37°Cのインキュベーターに戻します。5〜7日間のAAV感染により、理想的なレベルのGCaMP発現が得られることがわかりました。このウイルス感染の期間中は、2〜3日ごとに培地を交換し続けます。
>7. 19-21 DIV間の共焦点Ca2+ライブイメージング
- 記録バッファの準備
- 1 LのHEPES記録バッファーを作成するには、9.009 gのNaCl、0.3728 gのKCl、0.901 gのD-グルコース、2.381 gのHEPES、2 mLの1 M CaCl2ストック溶液、および500 μLの1 M MgCl2ストック溶液を800 mLの滅菌蒸留H2Oに加えます。最終容量を1 Lにします。
- 200 mLの20 μMグルタミン酸記録バッファーを作製するには、40 μLの100 mMグルタミン酸ストック溶液を上記の200 mLのHEPES記録バッファーに希釈します。
- 200 mLの10 μM NBQX記録バッファーを調製するには、200 μLの10 mM NBQXストック溶液を200 mLのHEPES記録バッファーに希釈します。
- 共焦点イメージング
- 滅菌済みの35mmシャーレに3mLの記録バッファーを入れます。
- 感染した培養物を入れた35 mmのシャーレを37°Cインキュベーターから取り出します。細い先端の鉗子を使用して、1つのカバースリップの端を慎重につかみ、記録バッファーで満たされたペトリ皿にすばやく移します。残りのカバーガラスを培地に戻して、37°Cインキュベーターに戻します。記録バッファーを装着したディッシュを共焦点顕微鏡に搬送します。
- イメージングソフトウェアを起動します。初期化中に次の手順に進みます。
- 蠕動ポンプを始動し、ラインを記録バッファーに配置します。流量を2 mL/minに校正します。
- 感染したカバースリップを35mmシャーレから記録槽に移します。
- 10倍水浸対物レンズとBFライトを使用して、焦点面を見つけ、ニューロン細胞体が高密度に集まっている領域を探します。40倍水浸対物レンズに切り替え、BFライトを使用してサンプルに再度焦点を合わせます。
- FluoViewの「色素リスト」ウィンドウで、AlexaFluor 488を選択して適用します。
- AAVの発現は変動する可能性があるため、蛍光色素の過度な露出や光退色を防ぐためには、低HVおよびレーザー出力の設定から始めます。AlexaFluor 488チャンネルの場合、高電圧(HV)を500に、ゲインを1xに、オフセットを0に設定します。488レーザーラインの場合、出力を5%に設定します。z平面で撮像される有効体積を増やすには、ピンホールサイズを300μmに大きくします。「フォーカスx2」スキャンオプションを使用して、発光信号をサブサチュレーションレベルに最適に調整します。ここから、各チャンネルの理想的な視認性が得られるまで設定を調整できます。
手記：GCaMPでCa2+フラックスの全範囲を正確に捕捉するには、ベースラインHVとレーザー出力の設定を調整して、検出器を過飽和にすることなく蛍光強度を増加させることができます。
- 顕微鏡の設定が最適化されたら、ステージを動かして、GCaMP6f蛍光の自発的な変化を示す複数の細胞が存在する領域を特定し、イメージングに必要な平面に焦点を合わせます。
- 「Clip rect」ツールを使用して、イメージングフレームを1秒弱のフレーム間隔を実現できるサイズにクリップします。これは、イメージング間隔を1フレーム/秒に設定するために必要です。
- [Interval] ウィンドウを 1.0 の値に設定し、[Num] ウィンドウを 600 に設定します。
手記：目的の時点(300秒)で異なる記録バッファを配信するには、ポンプの遅延を較正して新しいソリューションをバスに供給することが重要です。これは、溶液の灌流速度(2 mL/分)と、溶液のポンピングに使用するラインの長さによって異なります。
- tシリーズの動画を撮影するには、「Time」オプションを選択し、「XYt」スキャンオプションを使用してイメージングを開始します。
- イメージングプログレスバーを見て、適切な時点でラインをHEPES記録バッファーから20 μMグルタミン酸記録バッファーに移動します(たとえば、ポンプのレイテンシが60秒で溶液を送達するようにキャリブレーションされている場合、300秒でグルタミン酸を送達するためにラインを240フレームでグルタミン酸バッファーに移動します)。
- イメージングが完了したら、[シリーズ完了]ボタンを選択し、完成したtシリーズムービーを保存します。20 μM グルタミン酸をさらに 5 分間灌流し続け、培養ニューロンをグルタミン酸に合計 10 分間曝露します。イメージ化するカバースリップごとにこのプロセスを繰り返します。
- 20 μM グルタミン酸にさらに 5 分間さらした後、カバースリップを浴から取り出し、イメージングの日が完了するまで、記録バッファーを含む 35 mm シャーレに戻します。