ラットの子犬の脳からの鼻皮質-海馬スライスの準備

要約

出典: Valente, C. A., et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオは、ラットの子犬の脳から鼻皮質-海馬の切片を取得し、それらを培地で満たされたマルチウェルプレート内の膜状インサートで培養してさらに分析する方法を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 鼻皮質-海馬スライスの準備

>注:鼻皮質-海馬スライスの調製には、P6-7 Sprague-Dawleyラットを使用します。

1. 培養セットアップと培地調製
   1. 培養の前日に、必要な培地を準備し、4°Cに置きます。
   2. 解剖培地を調製します:Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)中の25 mMグルコース。
   3. 培地を調製する:50% Opti-MEM、25% HBSS、25% ウマ血清 (HS)、25 mM グルコース、30 μg/mL ゲンタマイシン。
   4. 維持培地を調製します:Neurobasal-A(NBA)、2%B27、1 mM L-グルタミン、30 μg / mLゲンタマイシン、HS(15%、10%、5%、0%)。.
2. ブレインハーベスティング
   1. 培養を開始する直前に、P1000ピペットで6ウェルプレートの各ウェルに1.1 mLの培地を加え、37°Cに置きます。
   2. すべての機器(解剖顕微鏡、ティッシュチョッパー、解剖ランプ、解剖ツール、電極、プレート、インサート、フィルターペーパー)を生物学的安全キャビネット内に置き、UV光の下で15分間滅菌します。
   3. スライスの厚さを350μmに調整します。
   4. GBSSを冷蔵庫から取り出します。6つのシャーレに5mLのGBSSを加えます。動物1匹につき6枚のシャーレが必要です。
   5. ネズミの子犬を安楽死させます。動物の脳幹の基部で鋭利なハサミを使用して斬首を行います。
   6. 動物の頭を冷たいGBSSで3回洗い、安全キャビネットに入れます。
3. 組織単離とスライスの調製
   1. 鋭い鉗子を眼窩にしっかりと挿入して頭を保持します。
   2. 細いハサミを使用して、椎骨孔から前頭葉に向かって正中線に沿って皮膚/頭皮を切り取り、脇に置きます。
   3. 頭蓋骨と同じように、脳横裂(脳と小脳の間の空間)に沿って切断します。湾曲した長い鉗子で、離して動かします。
   4. 嗅球はへらで捨てます。脳を頭から取り出し、背側を上にして氷冷したGBSSに入れます(図1A)。
   5. 細い鉗子を小脳に挿入し、へらが各半球を非常に慎重に開くように正中線に沿って進みます(図1B)。
   6. 短い湾曲鉗子を使用して、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆っている余分な組織を慎重に取り除きます。次に、へらで、各海馬の下に切り込みます(図1C)。
   7. 片方の半球を手に取り、海馬を上に向けて濾紙の上に置きます。もう一方の半球で手順を繰り返し、最初の半球と平行に濾紙に入れます。半球がブレードに対して垂直になるように、濾紙をティッシュチョッパーに置き、半球を350μmのスライスにカットします(図1D)。
   8. スライスした組織を冷たいGBSSを入れたシャーレに入れます(図1E)。
   9. 丸い先端電極を使用してスライスを慎重に分離します(図1F)。構造的に無傷の鼻皮質と海馬を持つスライスのみを保持します。DG領域とCA領域、および嗅内皮質と鼻周囲皮質を完全に定義する必要があります(図1G)。
   10. 各スライスをインサート(図1H-I)に、へらと丸い先端の電極を置きます。各スライスの周りの余分な解剖培地をP20ピペットで取り除きます(図1J)。4つの鼻皮質-海馬切片を1つのインサートで培養できます(図1K)。
4. 文化の維持
   1. メディアは一日おきに交換してください。
   2. 培地を37°Cで温めます。
   3. インキュベーターからプレートを取ります。プラスチックの端を鉗子で保持して、各インサートを持ち上げます(図1L)。
   4. フリーハンドを使用して、ウェルから培地を吸引します。インサートをウェルに戻し、P1000ピペットで1 mLに温めた新鮮な培地を加えます(図1M)。すべてのインサートに対して繰り返します。メンブレンと媒体の間に気泡が挟まっていないことを確認してください。

結果

図1:鼻皮質-海馬器官型スライスの調製に関する詳細な手順。(A)脳を頭から取り出し、背側を上にして氷のように冷たいGBSSに入れます。(B)鉗子を小脳に挿入します。正中線を通して脳を開き、海馬の上の余分な組織を取り除きます。(C)矢印で示されているように、海馬の下にヘラを切って。(D)両方の海馬を上向きにして平行に濾紙の上に置き、ティッシュチョッパーで350μmのスライスをカットします。(E)スライスした海馬を氷のように冷たいGBSSに入れます。(F)先端が丸いガラス電極を使用してスライスを分離します。(G)無傷の鼻皮質と海馬を描いたスライスのみを選択してくださ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メスのハンドル用ブレード	ファインサイエンスツール	10011-00
ブレイン/ティッシュスライスチャンバーシステム	ワーナー・インストゥルメンツ
細胞培養インサート、30 mm、親水性PTFE	ミリポアSAS	PICM03050
従来のインキュベーター	サーモサイエンティフィックヘレウス	BB15、ファンクションライン	37°C、CO2を5%に設定
D(+)-グルコース一水和物	メルクミリポア	1.08342.1000
D-(+)-グルコース溶液、45%水溶液	シグマ	G8769
リン酸水素二水和物	メルクミリポア	1.06580.1000
デュモン #5 ファイン フォーセプス バイオロジー イノックス	ファインサイエンスツール	11254から20
デュモン #5 鉗子スタンダード イノックス	ファインサイエンスツール	11251から20
デュモン #7 フォーセプス スタンダード デュモクセル	ファインサイエンスツール	11271-30
デュモンメディカル #7S 鉗子ショートカーブイノックス	ファインサイエンスツール	11273-22
ゲンタマイシン原液、50 mg/mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15750-037
ゲイの平衡塩溶液(GBSS)	バイオ産業	01-919-1A
ガラス電極	サイエンス製品	GB150F-10	ラウンドチップ自家製
ガラス製パスツールピペット、230 mm	VWRインターナショナル	〒612-1702
ホースセラム、ヒート不活化(HS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒26050-088
アイリススパチュラカーブ	ファインサイエンスツール	10092-12
ラボカルチャークラスII生物学的安全キャビネット	HERAサフェ	HSの12
L-グルタミン溶液 200 mM (Q)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-024
ニューロバサル-Aミディアム(NBA)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10888-022
Opti-MEM® I 低血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985-047
プラチナ5ブレード	ジレット
定性的濾紙、セルロース、グレード1、55 mm	ワットマン	1001-055	ミディアムリテンション 11μm
定性的濾紙、セルロース、グレード1、90 mm	ワットマン	1001-090	ミディアムリテンション 11μm
メスのハンドル	ファインサイエンスツール	91003から12
TC処理滅菌6ウェルプレート	コーニング	CORN3516
温度コントローラー	メディカルシステムズ(株)	TC-102
ティッシュチョッパー	The Mickle Laboratory Engineering Co., LTD.(ミックル研究所エンジニアリング株式会社)	MTC/2	350 μmに設定