感覚ニューロンの単離とナチュラルキラー細胞との共培養

要約

出典:Ahmadi, A., et al. Teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、酵素消化、機械的解離、および勾配遠心分離によるDRGニューロンの分離について説明しています。DRG細胞は、免疫細胞と感覚ニューロンとの間の相互作用を研究するために、細胞外マトリックス上でナチュラルキラー細胞と共培養されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. NK細胞の単離、培養、刺激

1. 侵害受容器ニューロンを無傷で生成する(同腹仔制御;lox-stop-lox-diphtheria毒素マウス(DTAfl/fl)とTRPV1cre/wtマウスを交配することにより、TRPV1wt::D TAfl/wt)およびアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウスを交配しました。
2. CO2吸入を使用して、ナイーブな同腹仔コントロール(TRPV1wt::D TAfl / wt)マウスを安楽死させます。
3. 500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った1.5 mLの微量遠心チューブに脾臓を回収します。
4. 乳棒を使用して脾臓を均質化します。
5. 細胞を滅菌PBS1 mLで希釈します。
6. 混合物を50 μmのセルストレーナーで15 mLのコニカルチューブにろ過します。
7. 滅菌PBSで容量(10mL)を補充します。
8. 10 μLを採取し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
9. 細胞を遠心分離(500 × g、5分)し、上清を取り除きます。
10. 細胞を10⁸細胞/mLの濃度で補充したRPMI 1640培地に再懸濁します。
11. 製造元の指示に従って、マウスNK細胞単離キットを使用して脾臓ナチュラルキラー(NK)細胞を磁気的に精製します。フローサイトメトリーを用いてNK細胞の純度を確認します。
12. 10 μLを採取し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
13. 細胞を遠心分離(500 × g、5分)し、上清を取り除きます。
14. NK細胞を補充したRPMI 1640培地(IL-2およびIL-15を含む)に再懸濁します。
15. 2 × 10⁶ NK細胞/mLを96ウェルU底プレートで48時間培養します。

>2. DRGニューロンの分離と培養

1. NK細胞刺激(ステップ1.15)の終了の24時間前に、96ウェルプレートに100 μL/ウェルのラミニン(1 ng/mL)をコーティングし、45分間(37°C)インキュベー
トします。
2. インキュベーション後、溶液を取り出し、バイオセーフティキャビネットでウェルを風乾させます。
3. CO2吸入を使用して、侵害受容器ニューロンを無傷で安楽死させます(同腹仔制御;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス.
   注:CO2吸入は、DRG(背根神経節)に接続された脊髄神経の破壊を避けるため、頸椎脱臼よりも好まれます。
4. マウスをボード上に腹臥位で固定し、皮膚を持ち上げ、背柱に沿って皮膚を切開します。
5. 腰仙関節を切り取り、ハサミで仙骨を腰椎から分離します。
頭蓋骨の
6. 基部に達するまで、脊椎の両側の筋肉と肋骨を頭蓋方向に切って脊椎を分離します。
7. はさみを使用して、環後関節で背骨を切り取ります。
8. 脊椎から筋肉と脂肪組織を取り除きます。
9. 脊柱をピンで留めて開き、脊髄を取り外してDRGにアクセスできるようにします。背根を介して脊髄に接続されているが、髄膜から分離されている椎間孔のDRGを探します。
10. DRGを10 mLの氷冷サプリメントDMEMで満たされた15 mLの円錐形チューブに回収します。
11. 調製物(200 × g、5分間、室温)を遠心分離し、上清を除去します。
12. コラゲナーゼIV(1 mg/mL)およびディスパーゼII(2.4 U/mL)を含むPBS250 μLを添加します。
13. DRGをコラゲナーゼIV/ディスパーゼII(C/D)溶液(80分、37°C、軽度の撹拌)でインキュベートします。数匹のマウスから神経節をプールする場合は、神経節あたり125 μLのC/D溶液の比率を維持してください。
14. 酵素を不活性化するには、サプリメントのDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地を5mL追加します。
15. 溶液を遠心分離し(200 × g、5分)、ピペットを使用して上清を穏やかに除去します。
16. 不要な細胞の損失を避けるために、上清を~100μL残します。
17. 補充したDMEM培地1mLを加えます。
18. ピペットガンとサイズが小さくなるパスツールピペット3本を使用して、DRGを1セル調製にゆっくりと三つにします(パスツールピペットサイズごとに~10
上下)。
19. バイオセーフティキャビネットで、ウシ血清アルブミン(BSA)を滅菌PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で最終濃度15%まで希釈します。1 mLのアリコートを-20°Cで保存します。
20. 15 mLのコニカルチューブにBSAグラジエントを作成するには、2 mLの滅菌PBSを添加し、チューブの底に1 mLの15% BSA溶液をゆっくりと分注します。ピペットをそっと取り外して、勾配を乱さないようにしてください。
21. P200ピペットを使用して、トリチュードされた神経節懸濁液(ニューロンを含む)をチューブの側面にゆっくりとピペットでグラジエントします。
22. ニューロン含有BSAグラジエント(200 × g、12分間、室温)を遠心分離します。遠心分離機の加速と減速を最低速度に設定します.
    注:遠心分離後、ニューロンはチューブの底に存在し、細胞の破片はBSA勾配に閉じ込められます。
23. ピペットを使用してすべての上清を静かに取り除きます。
24. 細胞を500 μLのNeurobasalに再懸濁します。
25. プレート 10 4 ニューロン/ウェル (200 μL の神経基底/ウェル) をラミニンコーティングされた平底 96 ウェルプレートに入れます。
    注:平均して、研究者はマウスあたり~8ウェルを充填することができます。
26. ニューロンを培養(37°C、一晩)して付着させます。

3. 共文化

1. ニューロン培養物から神経基底をゆっくりと取り出します。
2. IL-2およびIL-15による48時間刺激(ステップ1.14-1.15を参照)後、NK細胞を再懸濁し、ニューロン培養(96ウェル平底板)に10個の⁵ NK細胞/ウェルを添加します
   注:平均して、研究者はマウスあたり~6ウェルを充填することができます。
3. 補充した神経基礎MX(37°C、48時間)で細胞を共培養します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B-27	ジャクソン研究所	猫番号:009669
ウシ血清アルブミン(BSA)培養グレード	世界の精密機器	猫番号:504167
BV421 アンチマウス NK-1.1	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:12430112
セルストレーナー(50μm)	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:A3160702
コラゲナーゼIV	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:15140148
ディスパーゼII	フィッシャーサイエンティフィック	カタログ番号: 13-678-20B
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	フィッシャーサイエンティフィック	カタログ番号:07-200-95
EasySepマウスNK細胞単離キット	シグマ	カタログ番号: CLS2595
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ	カタログ番号: C0130
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	猫番号:806552
ガラスパスツールピペット	シグマ	カタログ番号: 470236-274
グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)	VWRの	カタログ番号: 02-0131
ラミニン	シダーレーン	カタログ番号:03-50/31
L-グルタミン	ギブコ	カタログ番号: A14867-01
マウス組換え体IL-15	ギブコ	カタログ番号:22400-089
マウス組換え体IL-2	ギブコ	カタログ番号:21103-049
神経成長因子(NGF)	ライフテクノロジー	カタログ番号:13257-019
神経基礎培地	ペプロテック	カタログ番号:450-51-10
ペニシリンとストレプトマイシン	ペプロテック	カタログ番号:210-15
乳棒	幹細胞技術	カタログ番号:19855
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	バイオレジェンド	猫番号:108732	クローンPK136
RPMI 1640 のメディア	バイオレジェンド	猫番号:137606	クローン29A1.4
ピンセットと解剖ツール。	バイオレジェンド	カタログ番号:65-0865-14
U字型底96ウェルプレート	バイオレジェンド	カタログ番号:101319
生存率染料eFlour-780	ベクトン・ディキンソン
CO2インキュベーター
解剖顕微鏡