感覚ニューロンの単離とナチュラルキラー細胞との共培養

要約

出典:Ahmadi, A., et al. Teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、酵素消化、機械的解離、および勾配遠心分離によるDRGニューロンの分離について説明しています。DRG細胞は、免疫細胞と感覚ニューロンとの間の相互作用を研究するために、細胞外マトリックス上でナチュラルキラー細胞と共培養されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. NK細胞の単離、培養、刺激

1. 侵害受容器ニューロンを無傷で生成する(同腹仔制御;lox-stop-lox-diphtheria毒素マウス(DTAfl/fl)とTRPV1cre/wtマウスを交配することにより、TRPV1wt::D TAfl/wt)およびアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウスを交配しました。
2. CO2吸入を使用して、ナイーブな同腹仔コントロール(TRPV1wt::D TAfl / wt)マウスを安楽死させます。
3. 500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った1.5 mLの微量遠心チューブに脾臓を回収します。
4. 乳棒を使用して脾臓を均質化します。
5. 細胞を滅菌PBS1 mLで希釈します。
6. 混合物を50 μmのセルストレーナーで15 mLのコニカルチューブにろ過します。
7. 滅菌PBSで容量(10mL)を補充します。
8. 10 μLを採取し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
9. 細胞を遠心分離(500 × g、5分)し、上清を取り除きます。
10. 細胞を10⁸細胞....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B-27	ジャクソン研究所	猫番号:009669
ウシ血清アルブミン(BSA)培養グレード	世界の精密機器	猫番号:504167
BV421 アンチマウス NK-1.1	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:12430112
セルストレーナー(50μm)	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:A3160702
コラゲナーゼIV	フィッシャーサイエンティフィック	猫番号:15140148
ディスパーゼII	フィッシャーサイエンティフィック	カタログ番号: 13-678-20B
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	フィッシャーサイエンティフィック	カタログ番号:07-200-95
EasySepマウスNK細胞単離キット	シグマ	カタログ番号: CLS2595
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ	カタログ番号: C0130
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	猫番号:806552
ガラスパスツールピペット	シグマ	カタログ番号: 470236-274
グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)	VWRの	カタログ番号: 02-0131
ラミニン	シダーレーン	カタログ番号:03-50/31
L-グルタミン	ギブコ	カタログ番号: A14867-01
マウス組換え体IL-15	ギブコ	カタログ番号:22400-089
マウス組換え体IL-2	ギブコ	カタログ番号:21103-049
神経成長因子(NGF)	ライフテクノロジー	カタログ番号:13257-019
神経基礎培地	ペプロテック	カタログ番号:450-51-10
ペニシリンとストレプトマイシン	ペプロテック	カタログ番号:210-15
乳棒	幹細胞技術	カタログ番号:19855
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	バイオレジェンド	猫番号:108732	クローンPK136
RPMI 1640 のメディア	バイオレジェンド	猫番号:137606	クローン29A1.4
ピンセットと解剖ツール。	バイオレジェンド	カタログ番号:65-0865-14
U字型底96ウェルプレート	バイオレジェンド	カタログ番号:101319
生存率染料eFlour-780	ベクトン・ディキンソン
CO2インキュベーター
解剖顕微鏡