初代胚性マウス中脳ドーパミンニューロンの単離と培養

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 準備

1. 0.46% D-グルコース、1% L-グルタミン、1% N2、0.2% プリモシンを含むドーパミン ニューロン メディウム (DPM) を調製し、ダルベッコの修飾イーグル培地/栄養混合物 F-12 (DMEM/F12) で完成させます。材料を混ぜた後、DPMをろ過します。DPMは4°Cで保存し、各アリコートを1回だけ温めます.
   手記：DPMには、ドーパミンニューロンのα-シヌクレイン蓄積を減少させるため、グリア細胞株由来成長因子(GDNF)を含めるべきではありません。
2. 非常に疎水性の高いシリコン化ガラスピペットを調製することで、胚性ニューロンの初期処理における表面への付着と細胞の損失を最小限に抑えます。
   1. 蒸留水1Lに10mLのシリコン化液を加え、2Lの容器で攪拌して混合します。ガラスピペットをシリコン溶液に15分間浸しておきます。
   2. ピペットを蒸留水で3〜5回すすいでください。ピペットを室温(RT)で一晩乾燥させるか、100〜120°Cの加熱滅菌スペースで1〜2時間乾燥させて、乾燥を早めます。
   3. 密封されたオートクレーブバッグで標準的なオートクレーブ滅菌により、ピペットを滅菌します。
3. ニューロンの播種に使用する96ウェルプレートの中央のウェルに60μLのPO溶液を添加することにより、底部が透明なポリ-L-オルニチン(PO)コーティング96ウェルプレートを調製し、エッジの影響を避けるためにプレートの端に少なくとも1行/列のウェルを残します。コーティングされたプレートを室温で4°Cまたは4時間で一晩保管します。
4. 細胞をプレーティングする前に、POを完全に吸引し、100 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄します。ウェルから1x PBSを吸引し、プレートの蓋を開けたままにして完全に乾燥させます.
   手記：使用済みのPOを収集し、再利用のためにフィルタリングすることが可能です。これは、同じPOソリューションに対して2回繰り返すことができます。
5. 50 μLのDPMを以前にコーティングしたウェルに添加します。100 μLのプラスチック製チップでウェルからDPMを吸引し、同時に円を描くようにウェルの底を引っ掻いて、各ウェルの周囲でコーティングを除去します。POコーティングされた島は、井戸の中央に残ります。
6. 層流フードの下に、コーティングされた各アイランドの中央に10μLのDPMを追加して、マイクロアイランドを作成します。
   手記： DPMで覆われたマイクロアイランドを持つプレートは、細胞の単離中に1〜2時間、層流フードの下に保持できます

2. 胚13.5日目(E13.5)マウス胚からの腹側中脳底の分離

1. 解剖する前に、10cmのシャーレにダルベッコのバッファーを入れ、氷の上に置いておきます。
2. E13.5妊娠中の雌マウスを施設のガイドラインに従って安楽死させます。マウスを仰向けに平らに置き、前部に70%エタノールをスプレーします。鉗子で子宮の上の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで切開して子宮を露出させます。
3. 子宮を慎重に取り外し、氷の上で前に準備したペトリ皿に入れます。
4. RTの層流フードの下にある手術用ハサミを使用して、子宮から胚を慎重に取り出します。鉗子で胚からすべての胎盤残留物を取り除き、ダルベッコの緩衝液で満たされた新しい10cmのペトリ皿に入れます。
5. 解剖鉗子または針を使用して、図1Aの黒い矢印でマークされた場所から頭の後肢を切り取ります。カットピースを胚の残りの部分から取り除きます(図1B)。
6. カットピースの後部を観察者に向けて置き(図1C)、尾側から頭蓋に向かってゆっくりと切り開きます(図1D)。頭蓋開口部の0.5 mm下から、図1Eに示すように、2 mm² –3 mm²領域を切断します。.
7. 腹側中脳底(図1Fを参照)を空の1.5mL微量遠心チューブに集めます。.すべての中脳の床がそれに集まるまで、微量遠心チューブを氷の上に置いてください.
   手記： あるいは、すべての胚脳を解剖した後、1mLのマイクロピペットで中脳の床を採取することもできます。

>3. E13.5マウス胚からの初代中脳培養を96ウェルプレート形式で確立

1. すべての胚から中脳の床を同じ1.5 mLチューブに採取した後、残留したダルベッコ緩衝液を取り出し、500 μLのCa2⁺、Mg2⁺フリーのハンク平衡塩溶液(HBSS)で組織片を3回洗浄します。
2. HBSSを取り外し、500μLの0.5%トリプシンをチューブに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
3. インキュベーション中に、1.5 mLのウシ胎児血清(FBS)を37°Cで温め、30 μLのDNase IをFBSに加えて混合します。また、シリコン処理されたガラスピペットの先端をファイヤーポリッシュします。穴に鋭いエッジがなく、1 mLマイクロピペットチップとほぼ同じサイズであることを確認してください><。 手記：別の方法として、低接着性の1 mLマイクロピペットチップをトリチュレーションに使用することができます。しかし、シリコン処理されたガラスピペットが最良の結果をもたらすようです。
4. ステップ3.2のインキュベーションが終了したらすぐに、500 μLのFBS/DNaseミックスを部分的に消化した組織に加えます。ガラスピペットを使用して、FBS /トリプシン混合物の組織を粉砕します。.組織が解離して、かろうじて見える小さな粒子になるまで回転させます。トリチュレーション中の気泡は避けてください。
5. 残った粒子を重力によって微量遠心チューブの底に沈殿させます。沈殿物を底部でピペッティングせずに、上清を空の15 mL円錐形ポリプロピレンチューブに集めます。
6. ステップ 3.3 (98:2) の FBS/DNase I を 1,000 μL の HBSS で希釈し、FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) を得ます。ピペッティングで上下に動かして混合します。1,000 μLの新しい混合物を、微量遠心チューブ内の残りの粒子に加えます。再度三回し、手順3.5を繰り返します。
7. 前の手順をもう一度繰り返して、すべてのFBS / DNase-I / HBSSを使い切ります(49:1:50)。
8. すべての上清が15 mLチューブ内に集まったら(ステップ3.5、3.7、および3.8)、卓上遠心分離機を使用して上清(~3 mL)を100 x gで5分間スピンダウンします。
9. DPMの2 mLをチューブに加え、100 x gで5分間スピンダウンして細胞ペレットを洗浄し、上清を取り除き、ペレット化された細胞内の破片を最小限に抑えるために2回洗浄を繰り返します。
   手記： 培養ニューロンには、常に新鮮で温められたDPMを使用してください。洗浄ステップでは、DPMは新鮮である必要はありませんが、37°Cに予温する必要があります。
10. 細胞を新鮮で温かいDPMで希釈し、微量遠心チューブに移します。希釈のためのDPMの量は、組織解剖に使用される胚の数によって異なります。例えば、150μLのDPMを使用して、10個の胚から得られた細胞を希釈します。
11. DPM中の細胞10 μLを微量遠心チューブに移します。これらを0.4%トリパンブルーステイン10μLと混合します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、生細胞(トリパンブルー陰性)をカウントします.
    手記：ウェルあたり30,000個の細胞をプレーティングに使用すると、ウェルあたり~1,000個のドーパミンニューロンが得られます。細胞密度が6μLあたり~30,000細胞を超える場合は、播種量が6μL以上になるように、播種前に細胞をDPMでさらに希釈します。
12. ウェルの底に触れずに、手順1.6で作成したマイクロアイランドからDPMを取り外します。
13. 各ウェルで再現性のある細胞密度を得るためには、ウェルに播種する前に、穏やかなピペッティングで細胞を混合します。1〜10 μLのマイクロピペットを使用して、ウェルの中央、前の各マイクロアイランドの位置に6 μLの細胞を追加します。
14. プレートの端にある空のウェルに150μLの水または1x PBSを入れて、ニューロン培養物を含むウェルからの蒸発を最小限に抑えます。プレートをインキュベーター内で37°C、5%CO₂で1時間インキュベー
トします。
15. 1時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を含む各ウェルに100 μLのDPMを加えて、インキュベーターに戻します。
16. めっきの2日後(in vitro 2日目、またはDIV2)で、25 μLを取り出し、75 μLの新鮮なDPMを添加して、最終的な培地容量を150 μLにし、蒸発をできるだけ避けます。
17. DIV5で培地の半分を新しいDPMと交換します(つまり、75 μLを取り出し、75 μLの新鮮なDPMを追加します)。DIV5 以降は、メディアの変更を行わないでください。

図1:E13.5マウス胚からの中脳底の解剖。 (A)頭部の後部の切断位置は、黒の矢印と白の破線でマークされています。(B)ピースは胚の残りの部分から取り除かれました。取り外したピースは丸で囲まれています。(C)ピースを90°回転させて、観察者に対して後方を向かせました。(D)ピースは、尾側から頭蓋側(白い破線でマークされている)の黒い矢印から開かれました。(E)開口部の0.5mm〜1mm下から、2mm2〜4mm2の領域を切り取りました(黒線でマーク)。(F)腹側中脳床は孤立していた(黒い破線の四角でマークされている)。スケールバー= 1 mm。