ショウジョウバエ幼虫の脳外植片の解剖と取り付け

要約

出典:Sheng, C., et al. ショウジョウバエニューロンの発達における高速樹状突起枝ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫からの脳外植片の解剖と取り付けを示しています。眼椎間板に付着した中枢神経系(CNS)を幼虫から抽出し、生理食塩水中のスライドガラスにマウントします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 幼虫の脳外植片の解剖と取り付け

1. 生理学的な外部生理食塩水(120 mM NaCl、4 mM MgCl₂、3 mM KCl、10 mM NaHCO₃、10 mMグルコース、10 mMショ糖、5 mM N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2 mM Ca²⁺、pH 7.2)で幼虫の脳を解剖します。一方の鉗子を使用して幼虫の体を所定の位置に保持し、もう一方の鉗子を使用して脳を慎重に解剖します。眼椎間板、脳葉、腹側神経索を温存します。イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えるために、付着した筋肉を取り外してください。
2. スライドガラス(25 x 75 x 1.0 mm³)を準備し、シリンジを使用して真空グリースで正方形のチャンバーを描画します。
3. 20 μLの外部生理食塩水を、グリースバリアのある正方形のチャンバーに加えます。
4. 鉗子を使用して、解剖した幼虫の脳をスライドガラス上のチャンバーに移します。解剖スコープの下の脳の位置を調整して、背側が上を向くようにします。
5. チャンバーをガラスカバースリップ(22 x 22 x 0.15 mm³)で覆います。幼虫の脳は、外部生理食塩水で満たされたチャンバー内のスライドに取り付けられます(図1B).
   手記：カバーガラスを優しく押すと、脳が閉じ込められ、その後のイメージングセッションでのサンプルドリフトが減少します。

結果

図1:樹状突起ダイナミクスイメージングおよび定量化プロトコルのワークフロー。(A)プロトコールには、サンプル調製、画像収集、画像処理、および樹状突起ダイナミクスの半自動定量化をカバーする6つのステップが含まれています。(B)背側を上にして装着された幼虫の脳外植片を含むイメージングチャンバーを示す模式図。脳外植片は、各葉に個別に標識された腹側外側ニューロン(LNv)を持ち、外部生理食塩水に浸されます。真空グリースバリアは、カバースリップの重量を支え、脳が動くのを防ぐ小さなチャンバーを形成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高真空グリース	ダウコーニング	79751から30
顕微鏡カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-E
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
試薬
グルコース
ヘープス
KClの
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBSの
蔗糖
テス

の