ショウジョウバエ幼虫の脳外植片の解剖と取り付け

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 幼虫の脳外植片の解剖と取り付け

1. 生理学的な外部生理食塩水(120 mM NaCl、4 mM MgCl₂、3 mM KCl、10 mM NaHCO₃、10 mMグルコース、10 mMショ糖、5 mM N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2 mM Ca²⁺、pH 7.2)で幼虫の脳を解剖します。一方の鉗子を使用して幼虫の体を所定の位置に保持し、もう一方の鉗子を使用して脳を慎重に解剖します。眼椎間板、脳葉、腹側神経索を温存します。イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えるために、付着した筋肉を取り外してください。
2. スライドガラス(25 x 75 x 1.0 mm³)を準備し、シリンジを使用して真空グリースで正方形のチャンバーを描画します。
3. 20 μLの外部生理食塩水を、グリースバリアのある正方形のチャンバーに加えます。
4. 鉗子を使用して、解剖した幼虫の脳をスライドガラス上のチャンバーに移します。解剖スコープの下の脳の位置を調整して、背側が上を向くようにします。
5. チャンバーをガラスカバースリップ(22 x 22 x 0.15 mm³)で覆います。幼虫の脳は、外部生理食塩水で満たされたチャンバー内のスライドに取り付けられます(図1B).
   手記：カバーガラスを優しく押すと、脳が閉じ込められ、その後のイメージングセッションでのサンプルドリフトが減少します。

図1:樹状突起ダイナミクスイメージングおよび定量化プロトコルのワークフロー。(A)プロトコールには、サンプル調製、画像収集、画像処理、および樹状突起ダイナミクスの半自動定量化をカバーする6つのステップが含まれています。(B)背側を上にして装着された幼虫の脳外植片を含むイメージングチャンバーを示す模式図。脳外植片は、各葉に個別に標識された腹側外側ニューロン(LNv)を持ち、外部生理食塩水に浸されます。真空グリースバリアは、カバースリップの重量を支え、脳が動くのを防ぐ小さなチャンバーを形成します。