人工多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

要約

出典:Phillips, A. W., et al.生理学的に適切なアッセイを用いた3次元幹細胞培養の調査のためのHiPSC由来無血清胚様体の開発。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を神経前駆細胞(NPC)に分化する技術を示しています。まず、ヒトiPS細胞はマウス胚性線維芽細胞(MEF)のフィーダー層で培養されます。その後、細胞を分離して生体高分子コーティングプレートに移し、MEFがhiPSCに接着して分離できるようにします。次に、懸濁したiPSCをV底プレートに移し、遠心分離して凝集体を形成します。最後に、分化培地を添加すると、凝集体内のhiPSCがNPCに分化します。

プロトコル

1. 神経前駆細胞の生成

1. γ線照射したマウス胚フィーダー(MEF)細胞層上の6ウェルプレートに線維芽細胞および末梢血単核細胞(PBMC)由来のヒトiPS細胞に由来するヒトiPS細胞に低分子を添加したヒトiPS細胞
   注意: 日常のメンテナンスは、以前に報告された手順の修正版です。
   1. 6 x 10⁵ MEFを6ウェル組織培養グレードプレートの各ウェルに300 μL/ウェル推奨培地でプレートします(メーカーのプロトコルに準拠)。
   2. 48時間後、MEF培地を300 μL/well hiPSC培地と1時間交換してから、hiPSCを添加します。
   3. 37°CのウォーターバスでhiPSCを素早く解凍し、1 mLのhiPSCをゆっくりと滴下します。hiPSCと培地を15 mLのコニカルチューブに移します。培地を加えて、総容量を5mLにします。129 x gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを1:1,000濃度のRho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む1 mLのhiPSC培地に穏やかに再懸濁します。
   4. 細胞懸濁液(通常、300,000細胞/ウェルで播種)をMEF細胞層に播種し、37°C、5%CO₂、95%湿度でインキュベートします。
   5. 光学顕微鏡を使用してiPS細胞培養を綿密に観察します。48時間後、縁が不均一である、嚢胞性に成長した、または光学顕微鏡下で黄褐色に見える培養物を取り除き、自発的な分化を最小限に抑えます><。 手記：7〜10日後、hiPSCコロニーが形成されるはずです。コロニーは丸く、境界が明確に定義され、細胞密度が均一で、不均一な細胞がゆるく詰まっていない必要があります。
   6. 丸いhiPSCコロニーを手動で選択して、自然分化細胞の培養をクリアします。コロニーを新しいMEFレイヤーに配置して拡大します。7日ごとに1:3に拡大し、文化が合流点に近づき、凍結します。
2. 細胞を増殖させ、凍結した後(バックアップ用)、プレート上でhiPSCコロニーを50〜75%のコンフルエンスに達するまで増殖させます。
3. 播種後7日後に、軽度の酵素処理(300 μLの酵素溶液で5〜10分)と穏やかなトリチュレーション(1,000 μLピペットで2〜4回)を使用して、神経前駆細胞分化のためのhiPSCを回収および調製します。
4. 細胞懸濁液を129 x gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5 mLのヒトiPS細胞培地に再懸濁します。細胞懸濁液を0.1%ゼラチンでコーティングした5 cm細胞培養皿に37°Cで1時間移し、MEFを除去し、hiPSCの収量を最大化します。培地(非接着性細胞を含む)を別の5cmゼラチンコーティング皿に移します。
5. 転写ピペットを使用して、非接着性細胞を15 mLの遠心チューブに移します。プレートを3mLの培地でやさしくすすぎ、15mLのチューブに加えます。
6. 細胞懸濁液を129 x gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを培地に穏やかに再懸濁します。自動セルカウンターを使用してセル数を決定します。9,000細胞/ウェルを96ウェルの低接着Vボトムプレートにプレートします。
7. プレートを163 x gで3分間遠心分離し、プレートを37°C、湿度95%、_CO25%でインキュベートします。ピペットを使用して、培地の半分を取り出し、新鮮な化学的に定義された分化培地1(DM1;図 1;資料表)14日間。

結果

図1:SFEBの準備の初期ステップを概説した概略図。 酵素解離法を用いてiPS細胞を回収した後、96ウェルプレートに播種し、163 x gで3分間遠心分離して迅速な凝集を誘導します。14 日後、in vitro (DIV) 細胞凝集体を 96 ウェルプレートからワイドボアピペットを介して細胞培養インサートを含む 6 ウェルプレートに移すことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SFEBニューロン分化細胞培養培地。試薬。コンポーネント
STEMdiff 神経誘導培地 (hiPSC Media)	STEMCELLテクノロジー	0-5835	250ミリリットル
PluriQ ES-DMEM MEDIUM (MEFメディア)	グローバルステム	GSM-2001
DM1メディア・コンポーネント
D-MEM / F-12(1X)、グルタマックス液、1:1	インビトゲン	10565018	385ミリリットル
ノックアウトセラム交換	インビトゲン	10828028	20% 100ミリリットル
ペン/連鎖球菌	インビトゲン	15140122	5ミリリットル
グルタマックス 200mM	インビトゲン	35050061	5ミリリットル
MEM 非必須アミノ酸溶液 10 mM (100X)、液体	インビトゲン	11140050	5ミリリットル
2-メルカプトエタノール(1,000倍)、液体	インビトゲン	21985023	900ul
低分子
Y27632 (ロッキ)	ステムジェント	04-0012-10	10μM
部品・材料
マウス胚性線維芽細胞	グローバルステム	GSC-6301Gの
96ウェルV底、蓋付き	常緑	222-8031-01V
StemPro Accutase 細胞解離試薬	サーモフィッシャー	A1110501
6ウェルフラットボトム	隼	353046