無血清胚様体の開発と維持

要約

出典: Phillips, A. W., et al. Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays. J. Vis. Exp.(2017年)。

ビデオでは、さまざまな無血清分化培地またはDMを使用して、ニューロン前駆細胞から無血清胚体(SFEB)を開発する手順について説明しています。DM-2はニューロンの成熟と配置を促進してSFEBを形成し、DM-3はさらなる成長維持に使用されます。

プロトコル

>1. 無血清胚様体(SFEB)誘導(図1)

1. 40 μmの細胞培養インサートを6ウェルプレートにセットし、凝集体を添加する少なくとも1時間前に1 mLの分化培地1(DM1)(材料表)を添加します。
2. 200 μLの広口先端を使用して20 μLの培地で神経前駆細胞凝集体を40 μmの細胞培養インサートに移し、培地をDM2に変更します(Table of Materials)
   手記：細胞培養インサートは、ウェルの底からわずかに離れた場所にある特殊なインサートで、プラスチックフレームに吊り下げられたポリテトラフルオロエチレンメンブレンで構成されています。このメンブレンは生体適合性があり、上部に配置されたSFEBへの栄養素と酸素の輸送を効率的に維持できます。これらは、マウスまたはラットから採取した器官型の海馬スライス培養物で一般的に使用されます。
   1. 4〜6個の凝集体を1つの細胞培養インサートに移し、凝集体間に十分なスペースを確保します。細いピペットチップ(例:200 μLチップ)を使用して、余分な溶液をできるだけ取り除きます。
      注:溶液がSFEBの周囲から除去されるときにSFEBが細胞培養インサート上を移動するため、SFEBを短時間乱すことは許容されます。
   2. DM2 1 mL で培養液を 37 °C、湿度 95%、CO2 5% で保持します。ピペットを使用して、培地の 4 分の 3 を取り除き、4 分の 3 の新鮮な培地と交換することにより、培地の 75% を 1 日おきに交換します。例えば、750 μLの培地を取り除き、750 μLの新鮮な培地を追加します。
3. 14日間の培養後、DM3培地(材料表)に切り替え、75%の培地を隔日で交換し、さらに16日間交換します。
4. 細胞培養インサートのSFEBを30日を超えて維持するには、60日、90日、120日と1日おきに培地を交換してください
   手記：SFEBは直径約1,000μmに成長し、通常は厚さ100〜150μmです。
5. 200 μLの広口ピペットチップを使用して培地を静かにピペッティングすることにより、SFEBをインサートから取り外します。SFEBを移すには、広口ピペットチップを使用して、体をピペットチップに優しく吸引します。SFEBをピペットチップにロードした後、12ウェルプレートに静かに移し、ウェルあたり300 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。

結果

図1:SFEBの成長と拡大中の中程度の変化とフェーズのタイムライン。

SFEBがインサートに移された後、14日目と28日目のin vitro(DIV)で2回の培地交換が行われます。通常、DIV 30、60、90 で実験のために収穫されます。上部の挿入図は、このプロセスのさまざまなフェーズを示しています。スケールバー = 1,000 μm (左端);1,000 μm (DIV 20);600μm(DIV 30);300 μm(シングルSFEB)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SFEBニューロン分化細胞培養培地。試薬。コンポーネント
STEMdiff 神経誘導培地 (hiPSC Media)	STEMCELLテクノロジー	0-5835	250ミリリットル
PluriQ ES-DMEM MEDIUM (MEFメディア)	グローバルステム	GSM-2001
DM1メディア・コンポーネント
D-MEM / F-12(1X)、グルタマックス液、1:1	インビトゲン	10565018	385ミリリットル
ノックアウトセラム交換	インビトゲン	10828028	20% 100ミリリットル
ペン/連鎖球菌	インビトゲン	15140122	5ミリリットル
グルタマックス 200mM	インビトゲン	35050061	5ミリリットル
MEM 非必須アミノ酸溶液 10 mM (100X)、液体	インビトゲン	11140050	5ミリリットル
2-メルカプトエタノール(1,000倍)、液体	インビトゲン	21985023	900ul
DM2メディアコンポーネント
D-MEM / F-12(1X)、グルタマックス液、1:1	インビトゲン	10565018	500ミリリットル
グルタマックス 200mM	インビトゲン	35050061	5ミリリットル
ペン/連鎖球菌	インビトゲン	15140122	5ミリリットル
N-2サプリメント(100X)、液体	インビトゲン	17502048	10ミリリットル
DM3メディアコンポーネント
ニューロベースルメディウム(1X)、液体	インビトゲン	21103049	500ミリリットル
B-27サプリメントマイナスビタミンA(50X)、液体	インビトゲン	12587010	10ミリリットル
グルタマックス 200mM	インビトゲン	35050061	5ミリリットル
ペン/連鎖球菌	インビトゲン	15140122	5ミリリットル
部品・材料
	ミリセル	PICM0RG50
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー	10010023	500ミリリットル