多電極アレイ上にパターン化された神経回路を構築

要約

出典: Kanner, S., et al. Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-Connected Circuits. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、パターン化された多電極アレイ(MEA)上でニューロン細胞を培養し、モジュール式のニューロンネットワークを確立するプロセスを示しています。この方法により、神経信号伝達と細胞相互作用の研究が可能になります。

プロトコル

1. MEA(Multi-Electrode Array)の準備

1. MEAを次の順序でクリーニングします(材料の表):
   1. 水道水で洗い、濃縮した酵素洗剤で3回超音波処理します。
   2. 蒸留水で3回超音波処理します。
   3. 蒸留水 (フード内、チップ1,000 μl) で3回洗浄し、紫外線 (UV) で30分間下に置いてください。
2. ネットワーク準備のサポート:
   1. 設計したサポートネットワーク型を準備します。
      1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)を12ウェルプレート(直径22 mm)に注ぎます。
      2. PDMSが固まったら、型を取り外し、メスで真ん中に穴を開けてリング状にします。
      3. 設計したサポートネットワークモールドをMEAの中央に配置し(図1A)、残りの表面をポリ-D-リジン(PDL)で室温(RT)で2時間覆います。
   2. ピペットを使用してPDLを取り出し、蒸留水で洗浄します。
   3. 型を取り外し、乾かしておきます(図1A)。
3. 次の方法でステンシルを MEA に位置合わせします。
   1. 指定されたマイクロマニピュレーターにステンシルを置きます。倒立顕微鏡を使用して、パターン化された構造を電極に正確に位置合わせし、ステンシルをMEA表面に配置されるまで下げます(図1B).
      手記：十分に洗浄されたMEAと接触すると、PDMSとMEA自体との間に競争力のある接着力が得られます。
   2. マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じてピンセットを使用してPDMSの上に少量の圧力を加え、MEAから外れないようにします。
   3. ステンシルをMEA表面にそっと押し付け、顕微鏡を使用してしっかりと取り付けられ、しっかりと位置合わせされていることを確認します(図1C-D)。
4. MEAを真空チャンバーに15分間置き、1 mLのPDLをステンシルに一滴垂らします。
5. 真空チャンバーに2回ずつ20分間挿入します。PDLをインキュベーター内でO / Nを乾燥させます。
6. めっきする前に、MEAからPDMSステンシルを取り外し、滅菌水で洗浄してください。UV照明下に7分間置きます。

2. めっき

1. 血球計算盤を使用してプレーティングに必要な細胞数を計算します
   1. 計数室(血球計算盤)が汚れていないことを確認し、その上にカバースリップを置きます(アルコールを使用して清掃します)。
   2. 細胞懸濁液10 μlを190 μlのめっき培地に希釈します (希釈1:20)。
   3. 希釈した細胞10μlを計数チャンバーの端にロードし、細胞をゆっくりとピペットで取り出し、チャンバーが自己充填するまで待ちます。
   4. 倒立顕微鏡を使用して、血球計算盤のグリッドを視覚化します。チャンバー内の細胞の数を直接カウントして決定します(健康な細胞は丸い必要があります)。大きな正方形内のセルを、端を横切るセルを数えません。
   5. 細胞の濃度を計算します:
      総細胞数/1000 μl = 希釈係数×カウントされた総細胞数 × 10⁴ (血球計算盤の面積).
      手記：例えば、希釈係数が20で、カウントされた総細胞数が100:
      100 × 20 ×^{10 4} = 0.1 x 10⁷ 細胞/1,000 μl または 1 x 10⁶/100 μl。0.75 x 10⁶細胞をプレートするために、細胞から75 μlを取り出します。
2. 1つのMEAまたはペトリ皿あたりのプレーティングに必要なセルの数を取り、凝集を防ぐためにセルを再懸濁し、パターン化された領域の中央にプレートします(必要に応じて細胞を培地で希釈できます)。MEAの場合は、中央に100μlの滴下を置きます。カバーガラスは、中央に1,000μlの滴を置きます。
3. めっき細胞を37°Cで40分間インキュベートし、めっき細胞にめっき培地をMEAあたり最大1 mL、カバーガラスあたり最大2 mLまで加えます。
4. 37°Cに保って、0.5ペン連鎖球菌、2%B-27、および0.75%グルタマックスを豊富に含む新鮮な増殖培地で4日ごとに希釈してください。
5. 6/7 DIV以降、島間の接続を確認した後、10 μl/ml FUDR(25 mg デオキシウリジン + 62.5 mg ウリジン12.5 ml MEM(Minimum Essential Medium Eagle))またはその他の抗有糸分裂剤で培地を希釈して、グリアの異常増殖を防ぎます。

結果

図 1.PDMSはMEA上に堆積します。(A)MEAにリング形状(赤矢印印)を装着したPDMSモールド。型は、支持ニューロンネットワークに向けられ、培養領域の周辺に位置する領域をコーティングするために使用されます(これは、MEAに取り付けられ、緑色の矢印でマークされたリングによって制限されます)。(B)マイクロマニピュレータを使用したMEA上のPDMSステンシルのアライメント。(C)アライメント後にMEAに堆積したPDMSステンシル。(D)10倍の倍率(電極間距離は500μm)を使用したMEA上のPDMSステンシルの画像。電極に対応してステンシルの穴に注意することができます。細胞接着に有利な接着層は、開いた領域にのみ堆積します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDMS、シルガード184	ダウコーニング
Nalgene 真空チャンバー	熱	〒5305-0609
ポリ-D-リジンPDL	シグマ	P7886
12ウェル培養プレート	シグマ	CLS3336
5-フルオロ-2'-デオキシウリジン	シグマ	F0503
MEA1060-INV-BC	マルチチャンネルシステム
TC02	マルチチャンネルシステム
ペン連鎖球菌	生物産業ベイト・ヘメク	03-033-1c
B-27	ギブコ	17504044
グルタマックス	ギブコ	〒35050-038
MEM 最小エッセンシャル ミディアムイーグル	生物産業ベイト・ヘメク	01-025-1B
マイクロ電極アレイ 4Q	マルチチャンネルシステム	60-4QMEA1000iR-Ti-PR	クリーニングマニュアル:http://www.multichannelsystems.com

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