人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

要約

出典:Garone, M. G., et al.PiggyBacベクターを使用したヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の機能性脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化させる過程を紹介しています。その根拠は、特定の転写因子を発現するように遺伝子改変されたiPS細胞を利用することにあります。この抗生物質をドキシサイクリンを含む培地で培養すると、転写因子の発現が引き起こされ、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化が促進されます。最終的に、前駆細胞をニューロン培地で培養して、成熟した機能的な運動ニューロンを生成します。

プロトコル

1. ヒトiPS細胞のメンテナンス

1. マトリックスコーティングプレートの調製
   1. マトリックスの5 mLバイアル1本(材料表を参照)を4°Cで一晩解凍します。元のマトリックスストックは異なるストック濃度で提供され、アリコートはデータシートに示されている希釈係数に従って作成され、個々のロットに固有です。マトリックスの早期ゲル化を防ぐために、バイアルとチューブを氷のように冷たく保つことが重要です。マトリックスを氷上の予冷クライオチューブ内のアリコートに分注します。未使用のアリコートは-20°Cで凍結します。
   2. 1つのアリコートを氷の上に約2時間置き、解凍します。
   3. マトリックスのアリコートを、50 mLのコニカルチューブに20 mLの冷たいDMEM/F12で希釈します。
   4. よく混合し、希釈したマトリックス1 mLを35 mmのディッシュに分注します(他のディッシュの表面積あたりの同量)。
   5. 希釈したマトリックスを含む皿を室温で1時間保持して、コーティングできるようにします.
      手記：パラフィルムで密封された皿は、4°Cで最大2週間保存できます。
2. ストック溶液(20 mL)と穏やかな細胞解離試薬の1xワーキングアリコートの調製(材料の表を参照)。
   1. 粉末をPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)に10 mg/mLに溶解します。
   2. フィルターは0.22μmのフィルターメンブレンを通して滅菌します。
   3. 20アリコート(各1mL)を調製し、-20°Cで保存します。
   4. 使用前に、1つのアリコートをPBS(Ca²⁺/Mg²⁺フリー)で1 mg/mL(1xワーキングアリコート)に希釈してください。.
      注:1x作業用アリコートは、4°Cで2週間保存できます。
3. ヒトiPS細胞の継代。
   1. 始める前に:4°Cで保存する場合は、インキュベーター内でマトリックスコーティングプレートを37°Cで20〜30分間温め、必要な量のヒトiPS細胞培地(材料表を参照)を室温で予温します。DMEM / F12を事前に温めます。
   2. 培地を吸引します。
   3. iPSCをPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)ですすいでください。
   4. 1xの穏やかな解離溶液(35 mmディッシュの場合は0.5 mL)を加えます。コロニーのエッジがプレートから剥がれ始めるまで、通常は3〜5分間、37°Cでインキュベートします。
   5. iPSCコロニーを剥離しないように注意しながら、穏やかな解離液を吸引します。
   6. DMEM/F12(35 mmディッシュの場合は2 mL)で細胞を洗浄し、細胞が剥がれないように注意しながら吸引します。この手順をもう一度繰り返します。
   7. ヒトiPS細胞培地(35 mmディッシュに1 mL)を加えます。
   8. セルリフターでコロニーを優しく切り離し、15mLのチューブに移します。
   9. P1000ピペッターで3〜4回ピペッティングして、細胞の塊をやさしく壊します。
   10. マトリックスコーティングされたプレートから上清を吸引します。
   11. ヒトiPS細胞培地の適切な培養量に細胞を播種します。分割比はラインごとに異なり、約1:4〜1:8です。媒体は毎日交換してください。

>2. NILおよびNIP誘導性iPS細胞系統の作製

1. 細胞トランスフェクション
   1. 細胞をPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)ですすいでください。
   2. 細胞解離試薬(材料表を参照)を添加し(35 mmディッシュで0.35 mL)、単一細胞が分離するまで37°Cでインキュベートします(5〜10分)。
   3. P1000ピペッターで3〜4回ピペッティングして、細胞分離を穏やかに完了します。
   4. 15mLのチューブに集め、PBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)を10mLに加えます。セルを数えます。
   5. 10⁶細胞をペレット化し、100 μlのBuffer R(細胞エレクトロポレーションキットに含まれています;材料表を参照)に再懸濁します。
   6. トランスフェクション用のプラスミドDNAを添加します:4.5 μgのトランスポーザブルベクター(epB-Bsd-TT-NILまたはepB-Bsd-TT-NIP12)と0.5 μgのpiggyBacトランスポゼースプラスミド
   。
   7. セルエレクトロポレーションシステム(材料の表を参照)を使用して、製造元の指示に従って、前述のパラメータ(1,200 V電圧、30 ms幅、1パルス)でトランスフェクションします。10 μM Y-27632(ROCK阻害剤、材料表参照)を添加したヒトiPS細胞培地に細胞を播種し、6 mmのマトリックスコーティング皿に入れます。
2. 抗生物質による選択
   1. トランスフェクションの2日後、5 μg/mLのブラストサイジンを培地に加えます。
   2. トランスフェクションされていないほとんどの細胞は、ブラストサイジン選択から48時間以内に死滅します。細胞をブラストサイジンに少なくとも7〜10日間保持して、ゲノムに導入遺伝子を統合していない細胞をカウンター選択します。
   3. トランスフェクションされた細胞を、導入遺伝子の数と組み込み部位が異なる細胞で構成される混合集団として安定して維持するか、単一のクローンを単離します。
   4. Ngn2の導入遺伝子特異的プライマーを用いたRT-PCRによる1 μg/mLドキシサイクリン誘導時の導入遺伝子の効果的な発現を確認するための追加のディッシュを準備します(転送:TATGCACCTCACCTCCCCATG;逆: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT)。
   5. この段階では、新規NIL-およびNIP-iPSC株のストックをヒトiPS細胞用の凍結培地で凍結します(材料表を参照)。

3. 運動ニューロンの分化

1. 記載されているように、細胞を細胞解離試薬で解離します(ステップ2.1.1.-2.1.3.)。解離した細胞を15 mLのチューブに集め、5容量のDMEM/F12で希釈します。細胞をペレット化し、10 μM ROCK阻害剤を添加したヒトiPS細胞培地に再懸濁します。マトリックスコーティングされた皿に細胞とシードを数え、密度62,500細胞/cm²で播種します。
2. 翌日、培地をDMEM/F12に交換し、1倍安定L-グルタミン類似体、1倍非必須アミノ酸(NEAA)細胞培養サプリメント、および1 μg/mLのドキシサイクリンを含む0.5倍ペニシリン/ストレプトマイシンを補充します。これは、分化の 0 日目と見なされます。1日目は、培地とドキシサイクリンをリフレッシュします。
3. 2日目に、培地をNeurobasal / B27培地(Neurobasal Mediumに1x B27、1x安定L-グルタミン類似体、1x NEAAおよび0.5xペニシリン/ストレプトマイシンを補充)に変更し、5μM DAPT、4μM SU5402、および1μg / mLのドキシサイクリンを含みます(材料の表を参照)。ミディアムとドキシサイクリンを5日目まで毎日リフレッシュします。
4. 5日目:細胞解離試薬による細胞解離(材料表を参照)。
   1. 細胞をPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)ですすいでください。
   2. 細胞解離試薬(35 mmディッシュに0.35 mL)を加え、細胞単層全体がディッシュから分離するまで37°Cでインキュベートします
      インキュベーション中に単一細胞が分離されないことに注意してください。
   3. 1 mLのDMEM/F12を加え、細胞を15 mLチューブに集めます。
   4. P1000ピペッターで10〜15回ピペッティングして、細胞分離を穏やかに完了します。
   5. 4mLのDMEM/F12を加え、細胞をカウントします。
   6. この段階で、製造元の指示に従って、運動ニューロン前駆細胞を細胞凍結培地(材料の表を参照)で凍結します。
   7. 細胞をペレット状にし、Neuronal Medium(Neurobasal/B27培地に20 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、および200 ng/mL L-アスコルビン酸を添加、10 μM ROCK阻害剤を添加)に再懸濁します。
   8. ポリオルニチン/ラミニンに細胞を播種するか、またはマトリックス被覆支持体に100,000細胞/ cm²の密度で播種します。免疫染色分析には、ポリマーカバースリップ付きのμ-Slideプラスチックサポート(材料表を参照)を使用してください。
5. 6日目に、培地をROCK阻害剤を含まない新鮮なNeuronal Mediumに変更します。次の日は、3日ごとにミディアムの半分を更新します。培地は、表面からの剥離を防ぐために非常に慎重に交換する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ	シグマ・アルドリッチ	A6964-100ミリリットル	細胞解離試薬
B27	ミルテニーバイオテック	〒130-093-566	神経細胞の維持のための無血清サプリメント
バンバンカー	日本ジェネティクス	NGE-BB02	細胞凍結培地、ここでは運動ニューロン前駆細胞に使用
BDNFの	プレプロテック	450から02	脳由来神経栄養因子
ブラストシジン	シグマ・アルドリッチ	203350	原核生物および真核生物のタンパク質合成を阻害するヌクレオシド系抗生物質
BSAの	シグマ・アルドリッチ	A2153の	ウシ血清アルブミン。免疫染色アッセイにおける抗体の非特異的結合を防止するブロッキング剤
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C3881	電気生理学的溶液用の化学製品
Corning Matrigel hESC 認定マトリックス	コーニング	354277	電気生理学的溶液用の化学製品
クライオステム ACF 凍結培地	バイオ産業	05-710-1E	ヒトiPS細胞の凍結培地
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G5146	電気生理学的溶液用の化学製品
DAPT	アディポゲン	AG-CR1-0016-M005	ガンマセクレターゼ阻害剤
ディスパーズ	ギブコ	17105-041	ヒトiPS細胞を穏やかに解離するための試薬
DMEM/F12	シグマ・アルドリッチ	D6421-500ミリリットル	細胞培養用基礎培地
ドキシサイクリン	シグマ・アルドリッチ	D9891-1Gの	epB-Bsd-TT-NILおよびepB-Bsd-TT-NIPベクターからの導入遺伝子の発現を誘導するために使用
DS2Uの	ウィセル	UWWC1-DS2U	商用ヒトiPS細胞ライン
GDNFの	プレプロテック	450から10	グリア由来神経栄養因子
Gibco Episomal hiPSC ライン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A18945の	商用ヒトiPS細胞ライン
グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050038	安定性が向上したL-グルタミンの代替品。細胞の健康を改善します。
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	H4034-J	電気生理学的溶液用の化学製品
L-アスコルビン酸	LKT研究所	A7210 (英語	抗酸化物質として細胞培養に使用
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	11243217001	in vitroで神経細胞の接着と増殖を促進する
NEAAの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140035	非必須アミノ酸。細胞増殖と生存率を高めるために、細胞培養培地のサプリメントとして使用されます。
ネオン100μLキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK10096	細胞エレクトロポレーションキット
ネオントランスフェクションシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK5000	細胞エレクトロポレーションシステム
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	アストロサイトフィーダー層を必要とせずに、ニューロン細胞集団の長期的な維持と成熟のために設計された基礎培地
ニュートリステム-XF/FF	バイオ産業	05-100-1A	ヒトiPS細胞培地
PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8662-500ミリリットル	ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、カルシウム、マグネシウム付き
PBS Ca2+/Mg2+ フリー	シグマ・アルドリッチ	ド8537-500ML	ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムなし、マグネシウムなし
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	4333-100ミリリットル	細菌による細胞培養汚染を防止するために用いられるペニシリン/ストレプトマイシン溶液です。
ポリオルニチン	シグマ・アルドリッチ	P4957	in vitroで神経細胞の接着と増殖を促進する
SU5402	シグマ・アルドリッチ	SML0443-5MG	血管内皮増殖因子受容体2の選択的阻害剤2(VEGFR-2)
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8787	4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール、t-オクチルフェノキシポリエチレンエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル。免疫染色アッセイにおける細胞透過化に使用
Y-27632(ROCK阻害剤)	エンツォライフサイエンス	ALX-270-333-M005	Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ(ROCK)の細胞透過性選択的阻害剤。iPS細胞の生存率を向上
μ-スライド8ウェル	イビディ	80826	固定細胞のハイエンド顕微鏡分析をサポート