出典:Sharif, R., et al.角膜組織工学:ヒト角膜の間質神経相互作用のInvitroモデル。J. Vis. Exp.(2018年)
このビデオでは、初代ヒト角膜線維芽細胞と分化した神経細胞の三次元共培養モデルシステムを生成する技術を示しています。この共培養システムは、間質神経相互作用の研究に使用できます。
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方法論記事
ヒト角膜線維芽細胞およびニューロンの3D共培養モデルの生成
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 初代HCF(ヒト角膜線維芽細胞)培養と3Dコンストラクトアセンブリ
- 以前にEMEM 10% FBS 1%抗生物質/抗真菌剤で栽培された外植片から3Dコンストラクトを組み立て、HCFを継代してカウントします。
- 3Dコンストラクトから0.4μmの細孔を持つポリカーボネートメンブレンインサートに、一次HCFの約1 x 10 6細胞/ウェルを播種し、コンストラクトの上部に1.5 mLの新鮮なEMEM 10% FBS 1%抗生物質/抗真菌剤を播種します。 各コンストラクトの底に同じ培地をさらに1.5 mL加えます。
- 細胞播種の24時間後、EMEM 10%FBS 1%抗生物質/抗真菌剤で細胞を培養し、0.5 mM 2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸(ビタミンC)で刺激し、各コンストラクトの上部に1.5 mL、下部に1.5 mLを添加します。
- 培養物をインキュベーター内で37°C、5%CO2で3週間保持し、研究期間中は1日おきに新鮮な培地を供給します。これ以上の通路は必要ありません。
2. 細胞分化と共培養
- 3週間後、10%FBS、1%抗生物質/抗真菌剤、および0.5 mM 2-O-α-D-アスコルビン酸(ビタミンC)を含む1.5 mLのEMEMを含む以前に組み立てた3Dコンストラクトの上に、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞の8 x 103細胞/ウェルを追加します。
- SH-SY5Y神経芽腫細胞が角膜間質細胞の上で少なくとも24時間増殖してから、細胞分化を開始します。
- コンストラクトの上に1% FBSと1.5 mLの10 μMレチノイン酸を含むEMEMで細胞を刺激することにより、SH-SY5Y細胞分化を開始します。1.5 mLのEMEM 10% FBS 1%抗生物質/抗真菌剤0.5 mM 2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸(ビタミンC)をコンストラクトの底に加えます。.レチノイン酸ステップは暗闇で行う必要があることに注意してください。
- この分化培地で細胞を5日間培養し続けます。
- 細胞が分化段階に達したら、2 nMの脳由来神経栄養因子(BDNF)とEMEMに添加された1%の抗生物質/抗真菌剤を含む1.5 mLの無血清培地に細胞を切り替えます。1.5 mLのEMEM 10% FBS 1%抗生物質/抗真菌剤0.5 mM 2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸(ビタミンC)をコンストラクトの底に加えます。. BDNF ステップは暗闇で実行する必要があります。
- 細胞をさらに2日間培養してから、さらなる分析のために処理します。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ダルベッコリン酸緩衝液 (1X) | ライフテクノロジーズのギブコ | 14190-144 | |
| 滅菌鉗子 | フィッシャーサイエンティフィック | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps (フィッシャーブランド ディスセクション エクストラファイン ポインテッド スプリンター フォーセプス |
| 片刃カミソリの刃 | ペルソナ | 270100 | |
| 滅菌メス用メス刃 No.10 | フェザーサージカルブレード | 2976年#10 | |
| イーグルの最小エッセンシャルミディアム | ATCCの | 2003年30月 | |
| ウシ胎児血清 | アトランタバイオロジカルズ | S11550 | 培地調製には10%FBSが必要です |
| 抗生物質-抗真菌薬(100倍) | ライフテクノロジーズのギブコ | 15240-062 | 培地調製には1%の抗生物質-抗真菌薬が必要です |
| 0.05%トリプシンEDTA(1X) | ライフテクノロジーズのギブコ | 25300062 | |
| 0.4μmの細孔を持つポリカーボネートメンブレンインサート | コーニング共演 | 3412 | |
| 2-O-α-ドグルコピラノシル-L-アスコルビン酸(ビタミンC) | シグマ・アルドリッチ | SMB00390-14 | この試験には 0.5 mM の濃度を使用する必要があります |
| SH-SY5Y神経芽腫細胞 | ATCCの | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| レチノイン酸 | シグマ・アルドリッチ | SRP3014-10UG | 10uMの最終濃度を使用する必要があります |
| BDNFの | シグマ・アルドリッチ | R2625-100MG | 2nMの最終濃度を使用する必要があります |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | VWR-アルファ・アエサル | 67勝68敗5 | 使用する超高純度グレード滅菌DMSO |
| Thermo Scientific Nunc 細胞培養処理済み EasYFlasks (T25) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc 細胞培養処理 EasYFlasks (T75) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-565-349 |
