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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. スライスの準備
- スライス回収チャンバーを構築または取得します.
注:回収チャンバーの原理は単純で、実験室で作ることができます(図1)。簡単に言うと、チャンバーは、人工脳脊髄液(aCSF)の表面よりも低いレベルで脳スライスを保持するためにバスケットが挿入される容器です。
- 例として、4つのリング(高さ4〜6 mm)を取得します(図1A、側面図;B、上面図)30ccの注射器を切断することによって。次に、リングの片側に伸ばしたネット(例えば、ナイロンホースから切り出したもの)を接着して脳のスライスを保持し(図1B)、リングを接着します。
注:グルーガンを使用できます。
- 4つのリングが接着されたら、湾曲した二等辺三角形のプラスチック壁を2つのリング(図1AおよびB)に接着して、回復した脳スライス(図1CおよびD)から酸素気泡をそらします。図1Dに示すように、プラスチックの壁と同じ側に酸素拡散システム(ここではガス分散チューブ)を挿入します。
- スライスする前に、酸素化(95%O2 / 5%CO2)し、スライス溶液(ステップ1.4を参照)を0〜2°Cに冷却します。
- カスタムリカバリーチャンバーに標準 aCSF を室温 (RT) で充填します。回収チャンバーにスライスを配置する前に、aCSFが十分に酸素化されていることを確認してください(20〜30分、時間はチャンバーの容量によって異なる場合があります)。気泡がスライスに直接接触したり、スライスを乱したりしないようにしてください。
- ビブレーターの製氷皿に氷を敷き、冷水を入れて、スライスチャンバーの3分の1から2分の1が水没するようにします。酸素供給システム(ガス拡散石など)と温度プローブをスライスチャンバーに慎重に配置して、アイテムがブレードの動きやスライス操作を妨げないようにします。
- 脳を摘出し、目的の脳領域を解剖するために必要な解剖領域とツールを準備します
注:実行される正確な解剖は、研究された特定の脳領域によって異なります。さまざまな脳構造は、さまざまな平面(たとえば、冠状、矢状、または水平スライス)でスライスする必要があります。
- 次のツールをアンダーパッドに置きます:斬首はさみ、メス、小さなまっすぐな鋭い先端のはさみ、血管カニューレ挿入鉗子(または、ラットの頭蓋骨により適したロンジャーなどの先端が広い手術用ツール)、湾曲止血鉗子、ピンセット、へら、すくいヘラ、濾紙、ペトリ皿、片刃かみそりの刃、シアノアクリレート接着剤。
- 温度が0〜2°Cに達したら、スライス溶液をスライスチャンバー(バッファートレイ)に移します。
- イソフルランを使用して乾燥チャンバー内でマウスに麻酔をかけます。正確な量は、使用するチャンバーのサイズによって異なりますが、小さなシューボックスケージの場合は、数滴(~3-4滴)を使用してください。マウスをケージに入れたままにします(触覚刺激に反応しない、ここで説明する条件で約15秒)。動物が深く麻酔をかけられていることを確認するために尾と足のピンチテストを行い、心臓の鼓動が止まる前に斬首します(細胞の生存率を高めます)
注:適切な正当化により、一部の研究所は、興奮毒性プロセスを可能な限り最小限に抑え、細胞の生存率を高めるために、生きた斬首を行う許可を得ています。
- 解剖を行います。
注:脳は迅速に抽出する必要があります(<45秒)。
- メスを使用して、頭蓋骨の上の表在性皮膚を吻側から尾側に切ります。
- 頭の両側の頭皮をむきます。
- 小さくまっすぐな鋭利な先端のはさみを使用して、ラムドイド縫合糸に沿って頭頂間板を切断し、小脳を取り除きます。後頭骨を取り除きます。
- 同じハサミを使用して、矢状縫合糸を切断します。
- 血管カニューレ挿入鉗子(またはラットの頭蓋骨を壊す場合はロンジャー)を各頭頂骨の下にスライドさせ、引っ張って脳を露出させます。
- 湾曲した止血鉗子を使用して、前頭骨をつまんで骨を折った後、ピンセットまたは血管カニューレ挿入鉗子を使用して骨折した骨を取り除きます。硬膜は解剖の妨げになる可能性があるため、できるだけ優しく切って取り除きます。
- へらを脳の下にスライドさせ、頭蓋骨からそっと引き出します。氷冷したaCSFをあらかじめ充填したスライスチャンバー(バッファートレイ)に入れます。脳を1〜2分間冷まします。
- ペトリ皿に氷と氷水を入れて解剖プラットフォームを準備し、表面の接触を増やします。皿に蓋をして、濾紙を上に置きます。濾紙を冷たいaCSFで濡らします。
- 脳が冷めたら、氷で満たされたシャーレに脳を置き、適切な解剖を迅速に行って、目的のスライス面を取得します。
- 側坐核(NAc)を含む矢状スライスを取得するには、片刃のカミソリの刃を使用して、嗅結節と小脳がまだ存在する場合はそれらを切断して除去します。次に、右半球の横方向の境界から2〜3 mmの矢状カットを実行して、試料保持プレートに接着される平らな表面を取得します(ステップ1.8.11を参照)
注:半球の横方向の境界からわずか2〜3 mmをカットすると、両方の半球からNAcを含むスライスを収集できます。適切な解剖は、調査される脳領域によって異なります。ここでは、NAcニューロンを矢状脳スライスに記録できるように、解剖を行います。
脳- の平らな切断面を、スライスの所望の平面に従ってプレート上に迅速に接着する(標本保持プレートに塗布されたシアノアクリレート接着剤を使用)。矢状脳スライスを取得するには、ステップ1.8.10を参照してください。
- すぐに検体保持プレートをスライスチャンバーに置き、固定して、脳が吻尾方向にスライスされるようにします(安全のため、ブレードホルダーは試料プレートが固定されているときのみ設置してください)。
- 適切なスライスパラメータ(材料に記載されているビブラトームのラボで使用されるパラメータ:速度3〜4、振動9〜10、スライス厚さ250μm)でビブラトームを設定します。
- スライス後、プラスチックでトリミングされたトランスファーピペットを使用して、脳スライスをリカバリーチャンバー(RT)に移します(ステップ1.3を参照)。回復時間は、研究中のニューロンのタイプによって異なる場合があります(通常は30〜90分)。
2. マイクロピペットとリグの準備の記録
- プーラーのユーザーズマニュアルの特定のガイドラインを参照して、目的のマイクロピペットの特性を取得してください。
注:MSNの場合、3.2〜4.0MΩのピペット抵抗範囲を使用します。
- aCSFを酸素化し、流量を2 ml /分に調整します。
- 灌流ヒーターコントローラーの電源を入れ、温度設定を調整して、目的の温度(例:31.8-32.2°C)を取得します。
注:温度安定性は、チャンバー内のaCSFレベルと流速が一定であることに依存します。ニューロンのいくつかの生物物理学的特性(例えば、入力抵抗、Ri、膜抵抗とも呼ばれるRM)は温度感受性であるため、安定した温度を維持することが重要です。
- コンピューター制御のアンプ、カメラ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡の背景光をオンにします。組織への電気刺激を必要とする実験を行う場合は、刺激コントローラーとアイソレーションユニットの電源を入れてください。
注意: 一部の amplifier他のメーカーのリファイアは、使用前に「ウォームアップ」を推奨しているため、正確な操作手順についてはマニュアルを参照することをお勧めします。
- カメラキャプチャ、信号取得、およびアンプソフトウェアを起動します。
- スライスの配置と視覚化:
- プラスチック製の先端トリミングされたトランスファーピペットを使用して、回復チャンバーから1つの脳スライスを静かに引き込みます。
- トランスファーピペットを記録チャンバーに置き、ピペットからスライスをチャンバーの底を覆うカバースリップにそっと絞ります。
注:オーバーフローが発生していない限り、回収チャンバーからのaCSFが浴にこぼれても無害です。
- 鉗子を使用してスライスの位置を変更し、目的の領域が記録チャンバーの中央に正確に配置されるようにします。顕微鏡の低倍率(4倍)対物レンズと接眼レンズを使用して、位置決めを支援します。
- 所望の位置に到達した後、チャンバー内のスライスホールドダウン(「ハープ」とも呼ばれる)で脳スライスの位置を固定します。
- 高倍率(40倍)の対物レンズに切り替え、チャンバー内のaCSFに接触するまでゆっくりと下げます。
- 微調整ホイールを使用して、組織にピントを合わせます。aCSFに接触している間は、対物レンズを過度に下げるとスライスが押しつぶされたり、チャンバーの底部を覆うカバースリップが壊れたりして、aCSFがコンデンサーにこぼれて損傷する可能性があるため、顕微鏡の粗調整ホイールを使用しないでください。
- 焦点が組織レベルにある場合は、ターゲット領域の細胞の形状を観察します。死細胞は、膨潤した原形質膜と核によって容易に識別できます(図1E)。健康な細胞は、丸い、卵形、または楕円形の均質な構造として現れるはずです(図1E)。
- ターゲットセルを探します。録音用マイクロピペットをガイドするために、コンピューターの画面に印を付けます。QCaptureなどのソフトウェアを使用している場合は、マウスの左クリックを押したままにして、ターゲットセルの周りに正方形を描きます。
- 対物レンズを持ち上げて、対物レンズがaCSFと接触することによって形成される円錐に十分なスペースを確保し、記録用マイクロピペットを配置して移動させます。
- マイクロピペットの配置と位置決め
- 1mlのシリンジ、非金属製のマイクロシリンジニードル、専用フィルターを用いて、計画された実験に従ってあらかじめ調製した内部溶液(K+ベースまたはCs+ベースの内部溶液、組成材料参照)をマイクロピペットに充填します。内部溶液がマイクロピペットホルダー内の塩化物被覆銀線電極に接触するように十分な溶液を使用してください。
注:銀線電極は、家庭用漂白剤に浸すことで塩素処理できます。ヌクレオシド三リン酸(アデノシン三リン酸、ATPおよびグアノシン三リン酸、GTP)は、使用前に内部溶液に添加することができます。溶液の入ったシリンジは、ATP/GTPの劣化を防ぐために氷の上に置いてください。
- マイクロピペットが組織内にある間に気泡が出てきてスライスを覆い隠す可能性があるため、マイクロピペットに気泡がないことを確認してください。
- マイクロピペットを電極ホルダーに入れ、溶液が塩化銀でコーティングされたワイヤー電極に接触するようにします。
- コーンワッシャーがマイクロピペットの周りにシールを形成するように、ピペットキャップを締めます。
- マイクロピペットをaCSFに浸す前に正圧を加えて、破片がピペットに入るのを防ぎます。
- ヘッドステージをロック位置(チャンバーに面している)に置き、マイクロマニピュレーターを使用して、浸漬された対物レンズのほぼ中央の下に来るようにチャンバーに向かってガイドします。
- マイクロマニピュレーター(中速から高速に設定)でマイクロピペットを動かしながら、コンピューター画面を使用してマイクロピペットの位置を特定し、X-Y軸上のセルの位置に誘導します。
- 電圧ステップ(例:4 mV、100 msec)を印加してマイクロピペットの抵抗を測定しますが、これは手動またはClampexソフトウェアの「メンブレンテスト」を使用する場合は「バス」モードなどの特定のソフトウェアを介して自動的に実行できます(ステップ4も参照)。気泡などの異物がマイクロピペットを塞がないように、ポリエチレンチューブでマイクロピペットホルダーに接続された空気入りシリンジ(30ccシリンジなど)で陽圧をかけてください。
- マイクロピペットをクリアした後、電圧オフセットを実行してピペット電流をゼロに減らすことができますが、これは手動またはコンピューター制御のアンプコマンダーの「ピペットオフセット」などの特定のソフトウェアを介して実行できます。
注:この機能は、バスとマイクロピペット溶液の間の濃度差(つまり、液体の接合電位)によって引き起こされる電圧を補償します。
3. 膜試験
>注:この手順は、資料に記載されているアンプに適用されます。
- コンピュータ制御のアンプコマンダーを使用する場合は、常に電圧クランプモードに設定してメンブレンテストを実行してください。
注:メンブレンテストが「バス」モードに設定されている場合、メンブレンテストでは、シールが形成されたときのマイクロピペット抵抗とシール抵抗を測定できます。
- 膜が破裂したら(ステップ4.8を参照)、膜試験を「セル」モードに切り替えて、直列抵抗(RS)(アクセス抵抗、RAとも呼ばれます)、RI、および膜容量(CP)を取得できます。
4. 最終アプローチ、シール形成、全細胞形状の取得
- ファインフォーカスホイールを使って、マイクロピペットを徐々に下げながらピントを合わせ始めます。常に最初に焦点を合わせてから、マイクロピペットを焦点面まで下げます。これにより、マイクロピペットの先端が突然スライスに浸透することがなくなります。
- マイクロピペットがスライスの表面に接触したら、マイクロマニピュレーターの速度を中低速モードに遅くします。
- ピペットホルダーに接続された空気入りシリンジで軽い陽圧を静かに加え、アプローチ経路から破片を取り除きます。
- X-Y-Zコントロールノブと交互に動かすか、Z軸ノブの回転に合わせてX-Z軸が両方とも変化する斜めにアプローチします(マイクロマニピュレータモデルで許可されている場合)。後者の方法は、組織の垂直方向の圧迫を防ぎます。
注:ここでの目標は、スライスに最小限のダメージを与えることによってセルに近づくことです。マイクロピペットが細胞に十分近づくと、くぼみが現れます(マイクロピペットの先端から加えられた陽圧によって細胞表面が丸く変色します)(図2)。
- くぼみが現れたら(図2-1)、ピペットホルダーの吸引チューブに接続されているチューブを通して弱く短時間の吸引を加えて、シールを作成します(図2-2)。メンブレンテストを監視し続けます.
注:パーシャルシールが形成されている場合(<1GΩ)、保持電位を下げて負の電流を注入すると(コンピューター制御のアンプコマンダーで)、シール形成が促進され、ギガオーム抵抗に達する可能性があります(「ギガオームシール」または「ギガシール」>1〜5GΩ)。シールの高抵抗(>1GΩ)は、記録された信号へのノイズ汚染を制限し、パッチの機械的安定性に貢献します。
- ギガシールが形成されている間は、コンピュータ制御のアンプコマンダーを使用して、細胞の保持電位を生理的静止電位(V静止)にできるだけ近づけ、膜が破裂した後の突然の変化を防ぎます。たとえば、MSN は通常、-70 mV または -80 mV (生理学的 V静止: -70 から -90 mV) で電圧クランプされます。
- ギガシールが形成されたら、高速および低速の静電容量を手動または自動で補償します。Multiclamp Commanderなどのコンピューター制御のアンプコマンダーを使用している場合は、「Cp Fast」と「Cp Slow」の「Auto」を押します。
- シールが安定しており、1 GΩを超える場合(または、細胞を目的の膜電位に保持するために10〜20 pA未満を注入する場合)、4.5と同じチューブを介して短時間強力に吸引し、原形質膜を破裂させます(図2-3)
注:これにはいくつかの試用が必要になる場合があります。良好な膜破裂は、破裂した膜がマイクロピペットを詰まらせないように十分に強く吸引が行われると達成されますが(記録中にRが増加する可能性があります)、膜または細胞の大部分を引き込まないように十分に弱く行われます。
- 全細胞構成が成功したら、マイクロピペットの位置を定期的に監視して、パッチの損失につながる可能性があるため、大幅なドリフトを評価して修正します。ドリフト振幅は、リグの設置品質やヘッドステージの引っ張り力など、いくつかの要因によって異なる場合があります。理想的には、ドリフトはほとんど存在しないべきです。
- メンブレンテストで「セル」モードに切り替えると、RI、RS、CPなどのセルのさまざまなパラメーターが表示されます。録音中にこれらのパラメータを監視します.
注:これらすべてのパラメータは、細胞および細胞タイプの初期の健康状態を評価するのに役立ちます(「膜試験」セクションのステップ4を参照)。
