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1. 6ウェルMEAおよびガラスカバースリップ上のrtTA/Ngn2陽性ヒトiPS細胞とニューロンの鑑別
>注:このプロトコルでは、6ウェルMEA(ウェルごとに9つの記録と1つの参照埋め込みマイクロ電極を備えた6つの独立したウェルで構成されるデバイス)上の逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター(rtTA)/ニューロゲニン-2(Ngn2)陽性のiPSCを区別するための詳細が提供されます。
- MEA の準備 (0 日目と 1 日目)
- 鑑別開始の前日に、製造元の推奨に従ってMEAを滅菌します。
- 接着タンパク質ポリ-L-オルニチン(PLO)を滅菌超純水で最終濃度50 μg/mLに希釈します。希釈したPLOを各ウェルに100 μL滴下して、6ウェルMEAの活性電極領域をコーティングします。
- 6ウェルMEAを、雰囲気5% CO2の加湿37°Cインキュベーターで一晩(O / N)インキュベートします。翌日、希釈したPLOを吸引します。6ウェルMEAのガラス表面を滅菌超純水で2回洗浄します。
- 冷たいダルベッコの改良型イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)でラミニンを最終濃度20μg/mLに希釈します。6ウェルMEAのアクティブ電極領域を直ちに、各ウェルに100μLの液滴を配置してコーティングします。
- 6ウェルMEAを加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5%CO2で少なくとも2時間インキュベー
トします。
- hiPSCsのプレート化(1日目)
注:ステップ1.2.1〜1.2.4に記載されている容量は、rtTA/Ngn2陽性のhiPSCが6ウェルプレートで培養され、1つのウェルの細胞が回収されることを前提としています。6ウェルMEAにセルをプレーティングするために必要な容量は、実験で使用する6ウェルMEAの数によって異なります。ステップ 1.2.6 から 1.2.8 で指定した数値を使用すると、さまざまな実験サイズにスケーリングできます。
- 温かいDMEM/F12、細胞剥離溶液(CDS)、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含むE8培地をR / Tに添加します。ドキシサイクリンを最終濃度4μg / mLに、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤をE8培地に加えます。
- rtTA/Ngn2陽性のhiPS細胞の使用済み培地を吸引し、1mLのCDSをhiPS細胞に加えます。加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5%CO2の3〜5分間インキュベートします。顕微鏡で細胞が互いに剥離しているかどうかを確認します。
- ウェルに2 mLのDMEM/F12を加え、1,000 μLのピペットで細胞を穏やかに懸濁し、細胞を15 mLのチューブに移します。7 mLのDMEM/F12を細胞懸濁液に加えます。細胞を200 x gで5分間回転させます。
- 上清を吸引し、調製したE8培地を2mL加えます。1,000 μLピペットの先端を15 mLチューブの側面に当て、細胞を穏やかに再懸濁して、hiPSCを解離します。顕微鏡で細胞が解離しているかどうかを確認します。
- 血球計算盤チャンバーを使用して細胞数(細胞数/ mL)を決定します.
注:80 - 90%のコンフルエントの6ウェルプレートウェルは、通常、合計で3.0 - 4.0 x 106細胞を生成します。
- 希釈したラミニンを吸引します。6ウェルMEAの場合、細胞を希釈して7.5 x 105細胞/mLの細胞懸濁液を得ます。6ウェルMEAの各ウェルの活性電極領域に100μLの細胞懸濁液を滴下して、細胞をプレート化します。
- 6ウェルMEAを加湿した37°Cインキュベーターに、雰囲気5%CO2で2時間置きます。
- 2時間後、調製したE8培地500μLを6ウェルMEAの各ウェルに慎重に加え、6ウェルMEAs O/Nを5%CO2の雰囲気の加湿37°Cインキュベーターに入れます。
- 媒体を変更する(2日目)
- 翌日、1%(v / v)N-2サプリメント、1%(v / v)非必須アミノ酸、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM / F12を調製します。ヒト組換えニューロトロフィン-3(NT-3)を最終濃度10 ng/mLに、ヒト組換え脳由来神経栄養因子(BDNF)を最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。中火を37°Cまで温めます。
- ラミニンを最終濃度0.2 μg/mLまで培地に加えます。得られた培地をフィルタリングします。6ウェルMEAと24ウェルプレートのウェルから使用済み培地を吸引し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAs O/Nを、雰囲気5% CO2の加湿37°Cインキュベーターでインキュベートします。
- ラットアストロサイトを追加(3日目)
注:このプロトコルに記載されているボリュームは、ラットアストロサイトがT75培養フラスコで培養されることを前提としています。培養物に添加されるラットの星状細胞が良質であることが重要です。ラットの星状細胞の品質が良いかどうかを確認するために、2つの基準を使用します。まず、ラットのアストロサイト培養物は、ラットの胚の脳からの分離後10日以内にコンフルエントに成長できるはずです。次に、ラットのアストロサイト培養を分割した後、ラットのアストロサイトは、コンフルエントでテッセレーションされた単層を形成できるはずです。ラットのアストロサイト培養物がこれら2つの基準を満たさない場合は、この培養物を分化実験に使用しないことをお勧めします。
- 0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)をRTに温めます。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)とDMEM/F12を1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンで37°Cに温めます。
- ラット星状細胞培養の使用済み培地を吸引します。5mLのDPBSを加えて培養物を洗浄し、優しく振り回します。
- DPBSを吸引し、5mLの0.05%トリプシン-EDTAを追加します。.トリプシン-EDTAを優しく振ります。加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5% CO2で5〜10分間インキュベー
トします。
- 顕微鏡で細胞が剥がれているか確認してください。フラスコを数回叩いて、最後のセルを切り離します。
- 5 mLのDMEM / F12をフラスコに加えます。.10mLピペットでフラスコ内の細胞を穏やかに粉砕します。細胞懸濁液を15mLのチューブに集めます。チューブを200 x gで8分間回転させます。
- 上清を吸引し、細胞を1 mLのDMEM/F12に再懸濁します。血球計算盤チャンバーを使用して細胞数(細胞/ mL)を決定します。
- 6ウェルMEAのウェルあたり7.5 x 104個のアストロサイトを添加し、5% CO2の雰囲気で加湿した37°CインキュベーターでMEAs O/Nをインキュベートします。
- 媒体を変更する(4日目)
- 2%(v / v)B-27サプリメント、1%(v / v)L-アラニル-L-グルタミン、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含む神経基礎培地を調製します。NT-3を最終濃度10 ng/mLに、BDNFを最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。さらに、シトシンβ-D-アラビノフラノシドを2μM.
の濃度まで添加します。
注:シトシンβ-D-アラビノフラノシドを培地に添加して、アストロサイトの増殖を阻害し、ニューロンに分化していない残りのhiPSCを殺します。
- 培地をろ過し、37°Cまで温めます。6ウェルMEAのウェルから使用済み培地を吸引し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAを、雰囲気5%CO2の加湿37°Cインキュベーターで維持します。
- ミディアムをリフレッシュ(6日目 - 28日目)
注:6日目から、2日ごとに媒体の半分を更新します。10日目以降、培地にはウシ胎児血清(FBS)が補充され、アストロサイトの生存率をサポートします。
- 2%(v / v)B-27サプリメント、1%(v / v)L-アラニル-L-グルタミン、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含む神経基礎培地を調製します。NT-3を最終濃度10 ng/mLに、BDNFを最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。10日目以降は、培地に2.5%(v / v)のFBSも補給します。得られた培地をろ過し、37°Cに温めます。
- 1000 μLピペットを使用して、6ウェルMEAのウェルから使用済み培地の半分を取り出し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAを、雰囲気5%CO2の加湿37°Cインキュベーターで維持します。
2. hiPSC由来ニューロンの神経生理学的プロファイルの確立
>注:分化誘導の2〜3週間後、hiPSC由来のニューロンはさまざまなダウンストリーム分析に使用できます。このセクションでは、hiPSC由来ニューロンの神経生理学的プロファイルを確立するために実行できるいくつかのダウンストリーム解析の例を示します。
- MEAを使用したニューロンネットワーク活動の特性評価
- MEAで培養したhiPSC由来ニューロンの電気生理学的活性を20分間記録します。記録中は、温度を37°Cに維持し、加湿ガス(5%CO2、20%O2、75%N2)の一定でゆっくりとした流れをMEAに膨らませることにより、媒体の蒸発とpH変化を防ぎます。
- 1200X増幅(MEA 1060、MCS)の後、MCSデータ・アクイジション・カードを使用して10 kHzで信号をサンプリングします。カスタムソフトウェアパッケージを使用してデータを分析します(スパイクおよびバースト検出)。