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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 溶液の準備
- 標準的な人工脳脊髄液(ACSF;表1)
- 高純度の塩と、以前に二重蒸留水ですすいだ清潔なガラスビーカーを使用して、新鮮な溶液を準備します。すべての細胞外および細胞内溶液の調製には、高品質の二重蒸留水を使用してください。
- 表1によると、2LのビーカーでNaHCO3を500mLの水に溶かし、別のビーカーで他の塩を溶かして二価イオンの沈殿を防ぎます。へらを二重蒸留水で体系的に洗浄し、塩を飲む前に乾かします。マグネチックスターラーを使用して溶解を均質化します。両方のビーカーからの溶液を適切な容量のフラスコに加え、適切な容量にします。
- 最終的な細胞外溶液が完全に透明で、沈殿物が微量でないことを確認してください。
- 95%O2と5%CO2(カルボゲンガス)からなるガス混合物を、ガラスマイクロフィルターキャンドル(Ø 13 mm)で20〜30分前にスライスします。ACSFの浸透圧(2〜3回の連続測定)を浸透圧計(最適範囲:314〜325 mOsmol/L)で慎重に制御します。調製後の残りの溶液は4°Cで保存し、3日以内に使用してください。
- 切削液(スクロース-ACSF;表2)
- 3Lの新鮮な溶液を準備します。1 Lを使用して、1匹の動物から脳のスライスを準備します。残りの溶液は4°Cで保存し、3日以内に使用してください
注:シナプス伝達を減らすために高Mg2+および低Ca2+濃度が使用され、一部のNaClは組織を保存するためにスクロースで置換されます。
- 細胞内ソリューション
- デュアル全細胞記録用の100 mL溶液を事前に調製します(表3)。
- 細胞形態の良好な回復を得るためにメチル硫酸塩を含めます。バイオシチン(0.1 - 0.4%)を添加して、その後、ニューロンの形態を調べます。記録中に樹状突起の伸長を追跡するために、蛍光色素(Alexa 594やSulforhodamine 101 41など)を含めます(オプション)。
- 細胞付着記録用の100 mL電極溶液を事前に調製します(表4)。この場合、内部ソリューションは、巨視的な過分極活性化陽イオン電流(Ih)を分離するように設計された高K+ソリューションであり、他の電位依存性イオンチャネルのブロッカーが含まれています。
- 細胞内溶液を-20°Cで2 mLアリコートに保存してください。新しいレコーディングセッションごとに新しいアリコートを使用してください。融解したすべてのアリコートの浸透圧を浸透圧計で注意深くチェックします。浸透圧が初期値に対応していない場合は、新しいアリコートを取ります。
- 溶液をアリコートから3mLシリンジに移し、その上に0.22μmの滅菌シリンジフィルターを置きます。記録セッション中はシリンジを氷の上に置いて、その化合物(ATP、GTP、またはクレアチンリン酸)の劣化を制限します。
2. パッチピペットの製作と充填
- 曳曳
- 水平電極プーラーと厚肉のホウケイ酸ガラス管を使用してください。全細胞および細胞付着記録の場合は、外径2 mm/内径1 mmをご使用ください。ガラス管が完全に汚れていないことを確認してください。
- そうでない場合は、最初にガラスキャピラリーを有機溶媒(エタノールなど)に浸し、次に二重蒸留水に浸します。ブンゼンバーナーで毛細管端を短時間加熱します。または、洗浄して加熱したガラス管をメーカーに直接注文することもできます(材料リストを参照)。
- 二体性樹状突起記録の場合、細胞内溶液を充填したときの体細胞ピペット抵抗が6〜10MΩおよび樹状突起ピペットの場合は8〜19MΩであることを確認してください(表3)。細胞付着記録のピペット抵抗を10MΩの抵抗に標準化して、ニューロンの体性樹状突起ドメインに沿って同等の結果を達成します。
- 毎回の録音セッションの前(毎日)またはパッチ適用の直前に新しいピペットを準備し、製造後5〜8時間後に使用します。ピペットは蓋付きのガラス容器に保管して、ほこりや先端の障害物から保護します。
- 研磨
- すべてのピペットチップをマイクロフォージで検査し、ヒートポリッシュして、メンブレンとの密閉性を高めます。マイクロフォージを使用する前に、プラチナ加熱フィラメントで小さなガラス片を溶かします。恒常性のために、プラチナフィラメントのこのガラスコーティングを毎日交換してください(Peter Jonas、私信).
手記： 細胞装着型記録に使用するピペットは、熱研磨工程の前にコーティングすることで、バックグラウンドノイズを低減することができます。溶融歯科用ワックスやシリコーンエラストマーなどの絶縁剤を使用して、ピペットをコーティングできます。
3. 脳スライスの準備
- 16〜19日齢の健康なWistarラットを使用してください。不健康な動物や低体温症や脱水症状に苦しむ動物は使用しないでください。スライスの準備を始める前に、動物を安全で静かな場所に保管してください。動物を準備している間、部屋に他の動物がいないようにしてください。動物を優しく操る。
- スクロースACSFを2つの400mLポリプロピレン(PP)ビーカーに注ぎ、-80°C冷凍庫に45分間置きます。各PPビーカーのマイクロフィルターキャンドル(Ø13mm)を使用して、スクロースACSF溶液にカルボゲンガスを供給します。
- スライサーと予備チャンバーを準備します
- 垂直方向の振動が非常に少ない高品質のティッシュスライサーを使用して、スライスの表面層への損傷を可能な限り最小限に抑えます。新鮮で丸ごとカミソリの刃をスライサーに固定します。
- カミソリの刃は、カッティングセッションごとに新しいものを使用してください。かみそりの刃を曲げないでください。かみそりの刃の表面にある脂肪膜を取り除かないでください(Josef Bischofberger、私信)。
- 可能な場合は、メーカーが提供するバイブロプローブで垂直振動を確認してください。または、カスタムメイドのバイブロプローブを使用します。ブレードの垂直方向の振動をできるだけ0μmに近づけるように低減します。
- スライス用の150 mLのリザーブチャンバーを準備します。標準のACSFをリザーブチャンバーに注ぎ、ウォーターバスに入れます。予備室溶液にカルボゲンを充填するには、マイクロフィルターキャンドル(Ø 6 mm)を使用します。カルボゲンの泡ができるだけ小さくなるようにしてください。
手記：スライスの品質を一定に保つために、2〜3か月ごとに新しいリザーブチャンバーを構築します。
- スライスをカットする
- 実験者が邪魔されたりストレスを感じたりしない静かな部屋で、子宮頸部髄質のレベルで手術用ハサミ(長さ150 mm)で動物を斬首します。
- 動物の頭頂部の皮膚をメスで鼻から尾側に切り、横方向に取り除きます。頭蓋骨の上部を尾側から頭の鼻の部分まで細いハサミで切り取り、頭蓋骨の両方の部分を横方向に取り除きます。細いヘラで脳を取り出し、カルボゲンで平衡化された氷冷(0〜4°C)スクロース-ACSFを含むPPビーカーに慎重に落とします.
手記：この一連の手順は、できるだけ早く行う必要がありますが、細心の注意を払って行う必要があります (<<1 分、約 40 秒)。
- 脳をPPビーカーの溶液に2~5分間保持し、脳の動きを防ぐためにカルボゲン圧力を調整します。カルボゲンの泡が大きすぎる場合は、マイクロフィルターキャンドルを新しいものと交換してください。
- 脳を9cmのシャーレに置き、その内側の底が厚さ~0.5cmのシルガード層で覆われています。このシャーレは事前に準備してください。
- 氷のように冷たいスクロース-ACSFで脳を囲みます。ACSF-スクロース溶液の液相が脳を沈めることを確認してください。冠状スライスの場合は、メスまたはカミソリの刃で冠状面の脳の前部を切り取ります。冠状切開で小脳を切除します。
- シアノアクリレート接着剤を試料トレイ(面積~1 cm2)に塗布します。前部がスライスステージを向くようにブレインブロックを貼り付けます。ガラス製のパスツールピペットの大きな開口部を使用して、貼り付けた脳の上にスクロース-ACSFを慎重に滴下し、その後、スライサーの切断チャンバーをゆっくりと沈めます。切断面(つまり、ブレードに当たる最初の組織)が脳の腹面になるように、標本トレイを操作します。
- 曲げたガラスマイクロフィルターキャンドル(Ø6mm)でカルボゲンをカッティングチャンバーに塗布します(オプション)。
- かみそりの刃を水平面を基準にして~15°の角度で調整します。黒質に到達する前に、尾側から鼻の方向に ~500 μm の冠状脳スライスをカットします。厚さを下げて、関心領域を含む厚さ300〜350μmのスライスをカットします。
- かみそりの刃の端に平行なシリンジに取り付けられた非常に細い灌流針を使用して、組織ブロックからスライスを分離します。針とシリンジの間に90°の角度を持つように針を曲げます。ティッシュブロックからスライスを取り外すときは、かみそりの刃に圧力がかからないようにしてください。
- スライスの保存
- ガラス製のパスツールピペット(電球に取り付けられている)の最大の開口部を使用して、スライスを予備チャンバーに移します。すべてのスライスがリザーブチャンバーに移されたら(Christoph Schmidt-Hieber、私信)、ウォーターバスの温度を34°Cに0.5〜1時間下げます。
- この期間が過ぎたら、ウォーターバスのスイッチを切り、スライスを室温に保ちます。リザーブチャンバー内のスライスの動きを避けるために、カルボゲン圧力を調整します。録音を開始する前に、スライスをさらに10〜20分間保持します。
- 装置とマイクロフィルターキャンドルは、スライス手順の最後に二重蒸留水で注意深く、かつ徹底的に清掃します。
>4. 黒体ニューロンにおける二重体細胞および体細胞記録とバイオサイトスファイ
リング
The - Axon Guideに記載されているスライスのパッチクランプセットアップの組み立ての説明に従ってください。
- 録音室の準備
- 記録チャンバーに1〜2mLの二重蒸留水を入れます。漏れがないことを確認します。記録チャンバーをシフトするXYテーブルに置きます。
- 酸素不透過性灌流チューブシステム(ポリテトラフルオロエチレン)を介して標準ACSFを記録チャンバーに供給します。チャンバー内の灌流を4〜5mL min-1の速度で安定させます。ACSFを含むビーカーと記録チャンバーを結合するチューブの長さをできるだけ短くしてください(1 m)。
- リザーブチャンバーから脳スライスを選択し、ガラス製パスツールピペットの最も大きな開口部を使用して記録チャンバーに移します。スライスをプラチナリングで覆い、録音チャンバーの底に固定します。平らなプラチナリング(Ø1.5 cm)を使用し、平行なナイロン糸(間隔>2 mm)を接着します。
- 光学系の調整と最適化
- 赤外(IR)ビデオ顕微鏡を使用してスライスを視覚化します。ケーラー照明51を調整し、微分干渉コントラスト(DIC)光学系または斜め照明(ダット勾配コントラスト-DGC)を最適化します。
- スライスの品質を確認します。コントラストが強すぎず、クレーターが小さく分散しているだけの、滑らかで均一な表面のスライスのみを保持します。
- 新鮮で未使用のパッチピペット2本に細胞内溶液を充填します(表3)。ピペット溶液が入った0.5mLチューブを使用して、毛細管現象によりピペットの先端を充填します。フィラメントのないピペットのチップ充填を加速するには、シリンジに取り付けられたチューブを使用してピペットの端に負圧を加えます。
- ピペットをスライスの表面の上に置きます
- 銀線に塩化物コーティングが施されているかどうかを確認します。
- ピペットをピペットホルダーに順番に挿入し、ピペットホルダー、三方タップ、圧力計を接続するチューブ回路を使用して正圧(~70 mbar)を加えます。ピペットを録音チャンバーの浴槽に下げます。
- 圧力計の圧力値が 1 ~ 2 分間一定であることを確認します。圧力が低下している場合は、ピペットホルダー内のチューブまたはシーリングOリングを確認してください。
- ピペットチップをビデオモニターの中央に置き、邪魔にならないようにします。ピペットに圧力をかけたり解放したりするときに、ピペットの先端が動かないようにしてください。
- モニターの中央、ピペットチップの位置に正確に小さな十字を描いて、ピペットチップのドリフトと振動を確認し、チップの可能な動きを5分間観察します。
- 電圧ステップ(5mV)を印加して、オシロスコープのピペット抵抗を監視します。パッチクランプアンプの保持電位を0mVに設定します。DCピペット電流がアンプメーターでゼロを読み取るように、ピペットオフセット電位をキャンセルします。
- ピペットをスライスまで下に移動し、表面上に維持します。
- 長い樹状突起を持つニューロンを選択してパッチする
- 黒質内で、IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC) を使用して、ほぼ同じ平面 (図 1A および 1B) で長距離を追跡できる長い樹状突起を持つ健康なニューロンを選択します。滑らかで均質な細胞体を選択してください。スライスの表面にある2つの強く対照的なセル(図1Cおよび1D)は、侵入しにくく、長期間にわたって安定した記録条件を維持する(安定した直列抵抗)ため、避けてください。スライス表面の下に体細胞が10〜30μmあるニューロンを選択します。
- 体細胞電極を体細胞に近づけ(40〜50μm離れて)、樹状突起電極を樹状突起に同じ距離で近づけます。2倍の倍率(4倍チェンジャー)を使用して、樹状突起の一部を選択してパッチします。モニター上で、倍率なしの2,100倍(1倍)と2倍の倍率で5,500倍の絶対倍率を取得します。
- 体細胞ピペットの圧力を10mbarわずかに解放します。必要に応じて、樹状突起ピペットと体細胞ピペットの圧力を調整して、スライス内の細胞構造(体細胞と樹状突起)の変位を避けます。
- 樹状突起ピペットをメンブレンの近くに配置して、小さなくぼみを確認します。ピペットチップの圧力を解放し、ピペットの抵抗を制御しながら樹状突起をパッチします。理想的な条件下では、ごくわずかな吸引力で良好なシールを得ることができます。
- ピペットのキャパシタンストランジェントの振幅を、高ゲインでフィルタリングの少ない電圧パルス51とオシロスコープを使用して、電流ステップの上でできるだけ小さくします。樹状ピペットで全細胞モードに入ります。