多電極アレイを用いた初代マウス渦巻神経節ニューロンの神経活動の解析

要約

出典:Hahnewald, S., et al. Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、一次マウススパイラル神経節ニューロン(SGN)培養からの自発的および刺激依存的な神経活動を多電極アレイ(MEA)で記録する方法を示しています。これには、MEAの洗浄と準備、自発的な神経活動の記録、および刺激依存性のニューロン活動を特定するための制御された電気刺激の適用が含まれます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 自発的および電極刺激依存的な活動を調査するための電気生理学的記録

1. 多電極アレイ(MEA)培養物を細胞外溶液で室温(RT)で洗浄します。
2. ティッシュで接点を乾かし、MEAをMEAセットアップに取り付けます.
   手記：マウント中に培養物を湿潤に保つために、培養物に細胞外溶液を少量加えます。
3. 300 μlの細胞外溶液を加え、10分間待ってから記録し、システムが安定するまで待ちます。
4. ソフトウェアの録音/取得ボタンを押して、すべての電極から2分間の自発的な活動を記録し、記録電極を特定します。
5. MEA電極刺激:適切なソフトウェアで刺激の振幅/持続時間/形状を選択し、それを複数の電極に連続して適用します。自発的な活動を示す電極に基づいて電極を選択します(ステップ1.4のように)。残りのすべての電極から記録します。
6. 刺激アーチファクトを排除するには、同じ電極から10回刺激します。培養物が10回のうち少なくとも8回反応する場合、電極による刺激に対して陽性反応と見なすことができます。
7. バックグラウンドノイズを特定するには、テトロドトキシン(TTX)を1 μMの濃度で培養物に塗布し、電位依存性ナトリウムチャネルをブロックし、2分間記録します。これを使用してスパイク検出(2.1および2.2)を行います。

2. データ分析

1. 適切なソフトウェアを使用して、標準偏差に基づく検出器とその後の識別器を使用して、各電極の自発的な活動を検出します。アクティビティは、高速の電圧過渡現象 (<5 ミリ秒) として現れます。
2. TTX処理されたサンプルの分析時にアクティビティが発生しないしきい値を選択します。各実験のしきい値を調整して、誤検出と偽陰性の検出を区別します。
3. 適切なソフトウェアを使用して、各電極の検出されたニューロン活動を標準的な手順に従ってラスタープロットとして観察します(図1A-Cを参照)。
4. 10ミリ秒のスライディングウィンドウ内で検出されたすべてのイベントを1ミリ秒刻みで合計することにより、ネットワークアクティビティの合計を決定して表示します。
5. 適切な解析ソフトウェアを使用して生データを表示することにより、刺激誘発活性を検出します。オフラインで 1 つのスパイクを手動で特定します。単一のスパイクは、スティミュレーションアーチファクトの後に発生する高速電圧過渡現象として現れます(図1Eの矢印)。例を図 1E に示します。
6. 実験に応じて、応答する電極の数、応答を達成するために必要な閾値、電極あたりの活動電位の数、およびその他の関心のあるパラメータを分析します。

結果

図 1.MEAでのデータ記録。(A)63個の電極のうち6個の自発的な活動を示す元の記録の痕跡。(B)スパイク検出後の図1Aの6つの電極のラスタープロット。各バーは 1 つの活動電位を表します。(C)すべての電極を含むラスタープロット(AおよびBなど)活性は、63個の電極(チャネル番号0〜63)から2分間記録されます。(D)合計持続時間が80μsec、振幅が80μAの二相性刺激を、1つの電極(図2FのE58)からの培養物の刺激に使用しました。(E)電極58からの刺激後に得られた生データトレースの代...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞外液(pH 7.4)
NaCl			145 mM
KClの			4メートル
MgCl2			1 mM
CaCl2			2 mM
ヘープス			5メートルメートル
Na-ピルビン酸			2 mM
グルコース			5メートルメートル
料
MEA電極	クワネバイオサイエンス		(スイス・ローザンヌ)
ソフトウェア
Labviewの	ナショナルインスツル		スイス
イゴルプロ	ウェーブメトリクス		レイクオスウィーガ、アメリカ

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