動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>注:手順に関与する各参加者は、基本的な外科的処置について適切な訓練を受け、動物実験を実施するための有効なライセンスを持っている必要があります。
1. 麻酔と前投薬
- ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でラットに麻酔をかけます(体重400-5550gの生後6か月齢の雄Wistarラットの初期用量は60mg・kg-1).
手記： このプロトコルは、ラットの示された系統、性別、または年齢に限定されません。また、ケタミン-キシラジンミックス、α-クロラロース、またはフェンタニル+ミダゾラム+メデトミジンなどの代替麻酔は、さまざまな研究目標により適している場合、または倫理委員会によって要求される場合に使用できます。
- 約5分後、鈍い鉗子でラットの後肢のつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。プロトコルの次のステップに進むのは、反射作用が観察されない場合にのみ行ってください。
- 挿管後の粘液産生を減らすために、0.05 mLのアトロピンを皮下に注射します。.
- 4%グルコース溶液、NaHCO3(1%)およびゼラチン(14%)を含む5mLのリン酸緩衝液を皮下注射する。このバッファーは、実験中、皮膚血管に吸収され、体液バランスの維持に役立ちます。
- 手術中、定期的に動物の反射行動をチェックし、必要に応じて麻酔を補充します(ペントバルビタールナトリウムの10 mg・kg-1・h-1)。.
2. 手術
- 左後肢の背側部分、足首から腰まで、背中側、尾から高胸部(Th)セグメントまで、胸部の左側、胸骨の上の首の腹側に毛皮を剃ることにより、動物を外科的治療のために準備
します
- 静脈ラインの配置
- ラットを閉ループ加熱パッドに仰向けに置きます(そして手足の固定で固定します)。
- 21枚刃を使用して、胸骨からあごにかけて皮膚を縦方向に切り込みます。
- 鉗子で皮膚を保持し、下にある組織から皮膚を分離します。
- 鈍的解剖技術を使用して、右頸静脈を露出させます。周囲の組織から静脈を慎重に解剖します。
- 分岐点のない静脈の部分を特定し、その下に2つの4-0合字を滑り込
ませます。
- 以前に特定された静脈の非分岐セグメントの近位端に1つの緩い結び目を作り、静脈のこのセグメントの遠位端に1つの緩い結び目を作ります。静脈を心臓の近位に固定し、次に静脈の遠位部分を結紮します。
- 虹彩はさみを使用して、クランプと遠方の結紮糸との間に切開を行います。静脈のフラップを保持し、クランプによってブロックされるポイントに事前に充填されたカテーテルを導入します。
- 静脈とカテーテルを鉗子で一緒に保持しながら、クランプを外し、カテーテルを静脈に数ミリ押し込みます。カテーテルの両端を静脈に固定し、皮膚に固定点を追加します。
3. 気管チューブの紹介
- 鈍い鉗子を使用して、胸骨舌骨筋を覆う2つの下顎腺を分離します。胸骨舌骨筋を正中線で分離して、気管を露出させます。
- 3つの4-0結紮糸を気管の下に滑り込ませ、次に気管チューブ挿入ポイントの下に2つの結び目を作り、上に1つの結び目を作ります。
- 喉頭の輪状軟骨の位置を特定し、3番目の気管軟骨の下に切開を行います。
- 気管チューブを気管に挿入し、事前に準備した結紮糸でチューブを所定の位置に固定してから、皮膚に追加の結紮糸を追加します。
- 分離した筋肉の上に脱脂綿の小片を置き、手術部位に皮膚を縫合します。
>4. 後肢神経の解剖
- 21ブレードを使用して、アキレス腱から股関節まで、左後肢の後側に縦方向に切り込み
を入れます。
- 鉗子で皮膚をつかみ、鈍解剖技術を使用して、切開の両側にある下にある筋肉から皮膚を分離します。
- 膝関節の後ろにある膝窩(大腿二頭筋で覆われている膝窩)の位置を特定し、ハサミを使用して、この筋肉の前部と後部の間に切り込み
を入れます。
- 上に移動して、大腿二頭筋の2つの頭を股関節までカットして、坐骨神経を露出させます。出血を防ぐために必要に応じて焼灼します。
- 坐骨神経の軟骨、脛骨、および一般的な腓骨骨の枝を特定します。
- はさみを使用して、腓腹筋の外側を内側頭から分離して、脛骨神経とその枝を露出させます。
- 55本の鉗子を使用して、腓腹神経の遠位端をつかみ、遠位に切開し、可能な限り解剖します。
- 総腓骨神経で手順を繰り返します。
- 鈍いガラス棒を使用して、血管を傷つけないように注意しながら脛骨神経を周囲の組織から分離し、遠位に切断します。
- 内側腓腹筋(MG)と外側腓腹筋およびヒラメ筋神経(LGS)を特定します。
- 55本の鉗子を使用して、MG神経とLGS神経を慎重に解剖し、周囲の組織から切り離しますが、それぞれの筋肉との接続を維持します。
- 生理食塩水を染み込ませた脱脂綿を露出した神経の下に置きます。
- 手術部位の皮膚を閉じます。
5. 椎弓切除術
- 21ブレードを使用して、仙骨から胸椎まで縦方向に切開します。
- 皮膚を下にある筋肉から分離します。
- 胸部と腰部の棘突起の両側の長筋を切断します。
- 鈍いエッジのメスを使用して、筋肉を脊柱から引っ込めて、各椎骨の横突起を露出させます。
- 鈍い先端のはさみを使用して、露出した脊柱に沿って横突起に接続されている筋肉の腱を切断します。必要に応じて止血剤を塗布します。
- Th13椎骨を肋骨が挿入された最も低い胸部セグメントとして識別し、細かいロンジャーを使用して、Th13からL2椎骨の棘突起と椎弓を取り除き、脊髄の腰部を露出させます。脊椎の安定化のための固定点として使用されるL3棘突起を損傷しないことを忘れないでください。
- Th12棘突起を取り除き、椎骨の背側表面をできるだけ滑らかにします。
- 鈍的解剖技術を使用して、筋肉をTh11椎骨から分離し、ホルダー挿入ポイントを作成します。
- 露出した脊髄部分に、生理食塩水を染み込ませた薄い脱脂綿を置きます。
- ラットを、脊椎を支え安定させるために、2本の平行棒とクランプ付きの2本の調整可能なアームを備えたカスタムメイドの金属フレームに移動します。
6. 記録と刺激の準備
- 脊柱固定と神経配置
- ラットをクローズドループ加熱システムに接続された加熱パッドのカスタムメイドフレームに置き、動物の体温を37±1°Cに保ちます。
- 心電図(ECG)電極を皮膚の下に挿入し、心拍数モニタリング用のアンプに接続します。
- 皮膚フラップを使用して、露出した脊髄の上に深いプールを形成します。
- 金属製のクランプを使用して、Th12横突起の下とL3棘突起にクランプを配置して脊柱を固定します。
- 脊柱が固定され、水平に配置されていることを確認してから、脊柱の両側に背腹圧を加えて筋肉を引っ込めます。
- プールに温かい(37°C)鉱油を入れ、この温度に保ちます。
- アキレス腱に4-0結紮糸を通し、手術した左後肢を持ち上げて伸ばし、足首が股関節と同じ高さになるようにします。
- 皮膚フラップを使用して、露出した脛骨神経、MG神経、およびLGS神経の上に深いプールを作ります。
- プールに温かい(37°C)鉱油を入れます。
- MG神経とLGS神経をバイポーラ銀線刺激電極に置き、矩形パルス刺激装置に接続します。神経ごとに別々の刺激チャネルを使用します。
>7. 表面電極の配置
- 露出した脊髄の左側尾側に銀色のボール電極を配置し、背中の筋肉に参照電極を挿入し、両方の電極を差動DCアンプに接続します。表面のボール電極は、神経からの求心性ボレーを記録するために使用されます。
- 定電流刺激装置を使用して、MG神経とLGS神経を0.1ミリ秒の矩形パルスで刺激し、3Hzの周波数で繰り返し、求心性ボレーを観察します。
- 神経活性化の閾値(T)を決定し、各神経を約3・Tの強度で刺激し、各神経の求心性ボレーの振幅を記録します。
- 表面電極吻側を動かし、手順を繰り返して、ボレーの振幅が各神経にとって最も高い脊椎セグメントを特定します。最大ボレー位置を決定したら、表面電極を脊髄から安全な距離に移動します。
- 筋肉麻痺と呼吸運動を減らすための気胸の形成
- 神経筋遮断薬でラットを静脈内麻痺させ、げっ歯類適合カプノメーター(臭化パンクロニウム、初期用量0.4 mg・kg-1、0.2 mg・kg-1の用量で30分ごとに補充)に沿って気管チューブを外部人工呼吸器に接続します。
- 呼気終末のCO2濃度を監視し、換気パラメータ(周波数、空気圧、流量)を調整して約3〜24%に維持します。
- 録音の側面にある5番目と6番目の肋骨の間の皮膚に縦方向に切開します。
- 先端が鈍いハサミを使用して、上にある筋肉を切断し、肋骨間の肋間腔を視覚化します。
- 小さくて鋭いハサミを使用して、肋間筋と胸膜に小さな切開を行い、肺を圧迫しないように注意しながら、鈍い鉗子の先端を開口部に挿入します。
- 鉗子を拡張させるか、小さなチューブを挿入して、実験中ずっと気胸を開いたままにします。
- 神経筋ブロック後、ECG周波数を確認して麻酔の深さを監視し、心拍数が400bpmを超える場合は麻酔薬を補充します。筋肉麻痺と気胸の形成により呼吸運動が減少し、記録の安定性が向上します。
8. 硬膜とピアメーターを開く
- #55鉗子を使用して、硬膜をそっと持ち上げ、L5セグメントからL4セグメントまで吻側に切り取ります。
- 一対の極薄5SF鉗子を使用して、MGまたはLGS神経からの最大の求心性ボレーのレベルに正確に、血管間の背柱を覆う小さなパッチをピアに作成します。
- 生理食塩水を染み込ませて乾燥させたジェルフォームの小片を使用して、必要に応じて出血をブロックします。
>9. 経脊髄直流刺激(tsDCS)電極の配置
- ラットの腹部の腹側の皮膚を、腰椎(L)4-L5脊椎セグメントの位置に対応する吻尾側レベルで小さく切開します。.
- 露出した皮膚フラップを金属製のクリップでつかみ、これが参照電極として機能します。
- 生理食塩水を染み込ませたスポンジを胸椎(Th)12椎骨の背側に置きます。スポンジのサイズがアクティブなtsDCS電極(直径5mmの円形のステンレス鋼板)のサイズと同じであることを確認してください。
- 細かいマニピュレーターを使用して、アクティブなtsDCS電極を備えたスポンジを骨に押し付け、電極の表面全体が均等に押されていることを確認します。
- リファレンス電極とアクティブtsDCS電極を、直流の連続的な流れを供給できる定電流刺激装置ユニットに接続します。
10. マイクロピペットの準備
- 微小電極プーラーを使用して、微小電極を調製します.
手記： フィラメント電極と非フィラメント電極の両方を使用できます。ただし、電極のシャンクは、下降中に脊髄を圧迫しないほど薄く、腹角に到達するのに十分な長さでなければならないことを忘れないでください。
- 脊髄に入るシャンクの長さが約3mm、電極先端の直径が1〜20μm以下、微小電極抵抗が10〜20MΩになるようにプーラー設定を調整します。
- 微小電極に2Mクエン酸カリウム電解質を充填します。
- 準備した微小電極をマイクロマニピュレーターに取り付け、1\u20122 μmのステッピング動作と定位キャリブレーションを可能にします。
- 微小電極を細胞内増幅器に接続し、参照電極を背中の筋肉に配置します。
- 神経筋ブロック後、心電図(ECG)の頻度を確認して麻酔の深さを監視し、ラットの心拍数が400bpmを超えないように麻酔薬を補充します。
11. 運動ニューロンの追跡と浸透
- 求心性ボレー記録電極を脊髄の背側表面に戻し、記録部位の位置に対して尾側にL6セグメントのレベルで
戻します。
- 内側腓腹筋 (MG) と外側腓腹筋およびヒラメ筋 (LGS) 神経を 3 Hz および 3T 強度の周波数で電気 0.1 ms パルスで刺激し、選択した神経内のアルファ運動ニューロンのすべての軸索を活性化します。
- マイクロピペットをピア内の選択したパッチに、内側の角度15〜20120°でドライブします(先端が横向きになります)。
- 表面下に下降した後、微小電極を較正し、その静電容量と電圧オフセットを補償し、すべてのパラメータが安定したときに脊髄の浸透を続けます。運動ニューロンプールの抗ドロミック電位は、それぞれの神経の刺激中に専用の運動核に近づく間、微小電極電圧トレースで見えます。
- 微小電極への浸透を1μmステップで進め、細胞内増幅器のバズ機能を定期的に使用して、電極先端の残留物を取り除きます。
- 運動ニューロンの浸透を観察するが、これは記録された電圧トレースの突然の過分極と抗ドロミックスパイク電位の出現によって特徴
付けられる。
12. 運動ニューロン膜と発火特性の記録
- 細胞内増幅器のブリッジモードでは、それぞれの神経枝を刺激することにより、抗ドロミック活動電位の「オールオアナッシング」の外観に基づいて運動ニューロンを特定します。後で平均化するために、後続の 20 個のトレースを記録します。
- 高品質のデータを確保するために、厳格な選択基準を実装します:静止膜電位が振幅が少なくとも-50 mV、活動電位が50 mVを超える振幅で正のオーバーシュート、膜電位が記録前に少なくとも5分間安定していること。
- 細胞内増幅器の不連続電流クランプモード(電流スイッチレートモード4〜8kHz)で、0.5msの細胞内脱分極電流パルスを使用して、運動ニューロンにオルソドローム活動電位を呼び起こします。オフライン平均化を行うには、少なくとも 20 回繰り返します。
- 細胞入力抵抗を計算するために、40回の短いパルス(100ミリ秒)の過分極電流(1nA)で運動ニューロンを刺激します。
- 振幅が大きくなる50msの方形波パルスで運動ニューロンを刺激し、単一のスパイクを誘発するために必要な脱分極電流の最小振幅としてのレオベース値を決定します。
- 500 msの矩形波パルスの脱分極電流を、0.1〜2 nA刻みで振幅を増やして注入し、運動ニューロンのリズミカルな放電を呼び起こします。
13. 経脊髄直流刺激法 (tsDCS)
- 運動ニューロンの安定した浸透を維持しながら、直流の経脊髄印加によって分極手順を開始します。実験計画に合わせて電流強度と印加時間を調整します(例:0.1mAで15分間)。
- DCのスイッチを入れた直後に、運動ニューロン膜電位を観察します。陽極分極(陽極としての能動電極)は膜電位の脱分極をもたらすはずですが、陰極分極(陰極としての能動電極)は反対の効果を引き起こすはずです。DC刺激に応答した静止膜電位の変化が一定であるかどうかを観察し、電界強度が影響を受けないようにします。
- 連続電流印加中は、手順5.3-5を5分間隔で繰り返します。
- DCの電源を切り、録音が不安定になるか、包含基準が損なわれるまで、5分間隔で手順5.3〜5を繰り返し続けます。
- 実験を終了し、致死量のペントバルビタールナトリウム(180 mg・kg-1)の静脈内投与を使用して動物を安楽死させます。.
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