全細胞パッチクランプ法を用いた内側前庭核ニューロンへのノイズ電流の印加

要約

出典:Stefani, S. P., et al. Stochastic Noise Application for the Assessment of Medial Vestibular Nucleus Neuron Sensitivity In Vitro.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用して内側前庭核ニューロンにサブスレッショルドノイズ電流を適用するプロトコルを実演し、ノイズ電流が電気刺激に対するニューロンの感度に与える影響を研究しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 動物

>注:マウスはオーストラリアのげっ歯類センター(ARC;パース、オーストラリア)で開催され、シドニー大学のMedical Foundation Building Animal Facilityで開催されました。

1. マウスを標準的な12時間の明暗サイクルに維持し、環境をエンリッチメントします。
2. すべての実験には、雄と雌のC57BL/6マウス(3〜5週齢)を使用してください。

2. 溶液の準備

1. 29 mM NaHCO₃、11 mMグルコース、120 mM NaCl、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH₂PO₄、2.2 mM MgCl₂、2.77 mM CaCl₂で構成される人工脳脊髄液(ACSF)1 Lを調製します。
2. 29 mM NaHCO₃、11 mMグルコース、241.5 mMスクロース、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH₂PO₄、2.2 mM MgCl₂、2.77 mM CaCl₂を含む200 mLのスクロース-ACSF(sACSF)を調製します。ACSFおよびsACSFにCaCl₂を添加する前に、カルボゲン(95%O₂および5%CO₂)で溶液をガス化してpHを7.4に確立し、カルシウムの沈殿(曇り)を回避します。
3. 70 mM グルコン酸カリウム、70 mM KCl、2 mM NaCl、10 mM HEPES、4 mM EGTA、4 mM Mg_2-ATP、0.3 mM Na_3-GTP からなる K⁺ ベースの細胞内溶液を調製し、最終 pH 7.3 (KOH を使用して調整)
   手記：細胞内溶液は0.22 μmフィルターでろ過し、-20°Cで0.5 mLアリコートに保存することをお勧めします。

3. 脳幹の準備

1. 脳幹抽出の前に、sACSFをカルボゲンで平衡化し、-80°Cで25分間冷却して氷スラリーを形成します。
2. 酸素に飽和したイソフルラン(3〜5%)でマウスを麻酔します(3mL /分)。後足の反射神経がなくなったら、鋭利なステンレス鋼のはさみでマウスの首を切り落とします。
3. かみそりの刃(#22丸みを帯びた)を使用して皮膚に矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させます。
4. 標準的なパターンのハサミの尖った端を使用して、ラムダに小さな切り込みを入れ、縦方向の亀裂に沿って切り込みます。
5. 浅く曲がったPearson rongeurs.
   を使用して、対になった頭頂骨と後頭骨を慎重に反射させます。 手記：この手順では、脳は、事前に調製された氷冷したsACSFスラリーを使用して、その場で連続的に浴されます。
6. かみそりの刃(#11ストレート)を使用して、前脳とその骨包み込みから脳幹を分離し、頭頂後頭溝と尾髄を切除します。
7. 分離された脳幹の腹側端を、以前に切断した台形ポリスチレンブロックに取り付けます。ティッシュペーパーの芯を使用して、解剖された組織の周りの余分な液体を取り除き、切断段階への組織の良好な接着を確保します><。 手記： ポリスチレンブロックは、中脳の吻側端が脊髄にフィットして先細になるように台形にカットされています。
8. シアノアクリレート接着剤を使用して、脳幹吻側の端が取り付けられたポリスチレンブロックを切断段階まで固定します。
9. 前進速度0.16 mm/s、振動振幅3.00 mmを使用して、MVN.
   の200 μm横スライスを準備します 手記： MVNの位置は、PaxinosマウスとFranklinマウスの脳アトラスを使用して決定されます。MVN(アトラスではMVeとしてリストされています)は、第4脳室の腹側に直接あり、小脳の付着の直前(下丘と卵管の間)で最大です。
10. プラスチックでトリミングされたピペットを使用して、スライスをカルボジン化ACSFに25°Cで少なくとも30分間置いた濾紙ディスクに移してから記録します。

4. インストゥルメント

1. 標準的な電気生理学的セットアップを使用して、全細胞パッチクランプ技術を実行します。
2. マイクロピペットプーラー(材料の表を参照)で2段階のプロトコル(加熱ステップ1:70、加熱ステップ2:45)を使用してマイクロピペットを準備します。
3. 浴槽に入れたとき、マイクロピペットは内部溶液で3〜5MΩの範囲の最終抵抗を持つ必要があります
   手記：使用される設定は、部屋の温度によって異なる場合があり、かなり頻繁に変更される可能性があります。

>5. 全細胞パッチクランプ電気生理学

1. MVNの個々のニューロンから全細胞パッチクランプ記録を得るために、記録ピペット内でK+ベースの内部溶液を使用します。
2. インキュベーションチャンバーから記録チャンバーに単一の組織スライスを移し、U字型の重りにナイロン糸を使用して固定します。カルボゲン化ACSFを25°C、3 mL/minの流速で記録チャンバーに連続的に灌流します。
3. マイクロピペットに内部溶液を充填した後、低倍率(10倍)の対物レンズを使用してMVNを見つけます。高倍率(40倍)の対物レンズを使用して、MVN内の個々のニューロンを見つけることができます.
   手記： 細胞の品質は、全細胞構成を達成しようとするときに、細胞の高品質な記録と耐久性を確保するために不可欠です。適切な細胞は、球形、反射性細胞膜、および目に見えない核を示します。不適切な細胞は、大きな目に見える核(卵状)と腫れた/縮小した外観をしています。
4. ピペットで組織を破る前に、少量の陽圧を加えて破片をピペットの先端から押し離します。
5. マイクロマニピュレーターを使用してピペットを選択したニューロンに向かって動かすと、ニューロン膜に小さなくぼみが形成されます.
   正圧を解放し、少量の負圧を加えます。
6. 1 GΩのシールが達成されたら、吸引ポートを介してピペットホルダーに穏やかで短く鋭い負圧を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞構成を作成します。
7. 標準的な手法を使用して、全セル電流クランプ記録を行います。

6. 個々の内側前庭核ニューロンへの正弦波ノイズと確率的ノイズの適用

1. 確率的ノイズと正弦波ノイズを3〜24 pAの振幅の範囲で適用して、ニューロンの閾値と発火率を決定します。
2. 刺激強度の低いものと高いものを組み合わせて感覚閾値を決定し、ANOVAを実行して違いを観察します(図1を参照)。
3. 脱分極電流ステップが個々の電流レベルごとに注入された/注入される予定の10秒間の平均発火率を計算します(つまり、合計7つのエピソード。図 2)。
4. 平均発火率の値を使用して、現在のプロットに対する発火率を生成し、線形回帰分析を実行して最適な線の勾配を決定します。ベストフィットラインの勾配は、ニューロンのゲインを示します。

結果

図1:12pAの閾値の客観的な決定。12 pA未満(3 pAおよび6 pA)および12 pA(18 pAおよび24 pA)を超える発火率をプールして平均化しました。次に、これらの平均を、ANOVAと、シャムと>12 pAの間、および<12 pAと>12 pAの間の統計的有意性を使用して分析しました。*p < 0.05。

図2:制御ノイズ、正弦波、確率的ノイズプロトコルの概略プロファイル。(A)MVNニューロンに適用される制御(ノイズなし)プロトコル。(B)周波数が2Hzの正弦...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CaCl2	シャーラウ	CA01951000	ACSFおよびsACSFに使用
D-(+)-グルコース	シグマ	G8270	ACSFおよびsACSFに使用
エグタ	シグマ	E0396-25G	Kベースの細胞内溶液に使用
ヘープス	シグマ	H3375-25G(英語版)	Kベースの細胞内溶液に使用
KClの	ケミサプライ	PA054-500G	ACSF、sACSF、細胞内溶液に使用
K-グルコン酸	シグマ	P1847-100G	Kベースの細胞内溶液に使用
Mg-ATPの	シグマ	A9187-500MG	Kベースの細胞内溶液に使用
MgCl	ケミサプライ	MA00360500	ACSFおよびsACSFに使用
NA3-GTPの	シグマ	G8877-100MG	Kベースの細胞内溶液に使用
NaCl	ケミサプライ	SO02270500	ACSFおよび細胞内溶液に使用
NaH2PO4.2H 2O	アヤックス	AJA471-500G	ACSFおよびsACSFに使用
NaHCO3	シグマ	S5761-1KGシリーズ	ACSFおよびsACSFに使用
蔗糖	ケミサプライ	SA030-500G	sACSFに使用
イソフルラン	ヘンリー・シャイン	1169567762	マウスの麻酔に使用
備品
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	ワーナーインストゥルメント	GC150T-7.5	外径1.5mm、内径1.16mm、7.5cm 長さ
データ収集ソフトウェア	アクソグラフ		電気生理学および分析に使用
フリードマン・ピアソン・ロンガーズ	世界の精密機器	14089	解剖に使用
マイクロピペットプーラー	成茂	PP-830	マイクロピペットに使用
マルチクランプアンプ	Axonインスツルメント	700バーツ	電気生理学に使用
pHメーター	科学的な輝き	860033	内部ソリューションに使用
定番パターンハサミ	FSTの	14028から10	解剖に使用
サッターマイクロマニピュレーター	サッター	MP-225/M	電気生理学に使用
正立顕微鏡	オリンポス	BX51WI	電気生理学に使用
ビブラトーム	ライカ	VT1200	脳組織のスライスに使用

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