生細胞蛍光イメージングによる培養ニューロンの過酸化水素濃度の検出

要約

出典:Terzi, A. et al., ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、roGFP2-Orp1バイオセンサーとライブセルイメージング技術を使用して、網膜神経節細胞の過酸化水素レベルをリアルタイムで検出する技術を示しています。本稿では、細胞調製、蛍光イメージング、過酸化水素レベルの定量化に関与するステップを概説しています。

プロトコル

1. 培養網膜神経節細胞(RGC)ニューロンのin vitro活性酸素種(ROS)イメージング

1. イメージングの日(通常は細胞プレーティング後6〜24時間後)に、顕微鏡で網膜神経節細胞をチェックし、RGC軸索の成長を検証します。
2. 生細胞イメージングでは、カバースリップを培養皿から生細胞イメージングチャンバーに移します。
3. イメージング用の顕微鏡をセットアップします。微分干渉コントラスト(DIC)対物レンズ、OG590ロングパスレッドフィルター、EM-CCDカメラを搭載した倒立顕微鏡をご使用ください。
4. イメージングの前に、ゼブラフィッシュ細胞培養液を血清および抗生物質入り(ZFCM)(+))を血清および抗生物質を含まないゼブラフィッシュ細胞培養液(ZFCM(-))に交換します。
5. 細胞を10倍対物レンズで配置したら、高NA油浸対物レンズを使用して60倍倍で画像を取得します。さらに1.5倍の倍率を使用してください。
6. まず、DICイメージを取得します。次に、適切なフィルターセットを使用してroGFP2-Orp1を画像化します。405/20nmと480/30nmの励起フィルターを順次加振してroGFP2-Orp1を励起し、ダイクロイックミラー505DCXRを発光光が通過した後、535/30nmの発光フィルターで画像を取得します。
7. 最初の画像セットを撮影した後、メディアを異なる処理ソリューションを含むメディアと交換します。培地は、pH と浸透圧の変化を避けるために、イメージングの 30 分ごとに交換する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mm培養皿	ザルシュテット	〒83-3900
カバーガラス	コーニング	2850から22
使い捨てペトリ皿(100 x 15 mm)	VWRの	25384-094
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26140087
倒立顕微鏡	ニコン	TE2000
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017-015
LeibovitzのL-15ミディアムとフェノールレッド	ギブコ/フィッシャーサイエンティフィック	11-415-064
LeibovitzのL-15ミディアムフェノールレッドなし	ギブコ/フィッシャーサイエンティフィック	〒21-083-027
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
フェノールレッド	シグマ・アルディッチ	P0290
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマ・アルディッチ	P7280
ステリトップ 0.22 μm フィルター	ミリポア	S2GPT05RE
塩化カルシウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	C79-500
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7528
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H4034-J

の場合 型 の