出典:Camiré, O., et al.脳スライスのニューロン樹状突起における2光子カルシウムイメージング。J. Vis. Exp.(2018年)。
このビデオは、脳海馬スライスにおける全細胞パッチクランプ記録と2光子カルシウムイメージングのプロトコルを示しています。この方法により、急性脳スライスのさまざまなニューロンタイプの樹状突起における局所Ca2+過渡現象(CaT)のダイナミクスを研究することができます。
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方法論記事
脳切片の2光子カルシウムイメージングのための全細胞構成の確立
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査によってレビューされ、承認されています。
1. 事前準備 (オプション: 1日前から準備)
- 3種類の人工脳脊髄液(ACSF)溶液(正常液、ショ糖液、リカバリー液、各1L、表1参照)を調製します。溶液の浸透圧を300±10 mOsmに調整し、ACSF-スクロースを氷点近く(0-4°C)まで冷却します
手記：低ナトリウム切断液(ACSF-スクロース)の使用は、急性スライスの表層におけるニューロンの生存率を維持するのに役立ちます。 - 赤色の蛍光色素(例:Alexa-594)と緑色の合成カルシウムインジケーター(例:オレゴングリーンBAPTA-1;表1を参照)を含む0.75 mLのパッチ溶液を調製します。記録された細胞の事後形態学的同定が必要な場合は、パッチ溶液にバイオシチン(表1を参照)を含めます。
- 溶液の浸透圧を280 ± 5 mOsmに、pHを7.35 ± 0.5に調整します。溶液は常に冷蔵庫または氷の上に保管してください.
手記：カルシウムインジケーターの選択は、そのダイナミックレンジと調査対象のCa2+イベントの性質に基づいて行う必要があります。 - マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(材料の表を参照)から≈2μmのチップ(ピペット抵抗3〜5MΩ)を備えたパッチピペットを準備し、ホウケイ酸θガラスキャピラリーからの刺激ピペット(材料の表を参照)を2〜5μmのチップで調製します><。 手記：特定の直径と形状のピペットを作成するためのプーラー設定は、プーラーフィラメントのタイプと特定のタイプのガラスのランプテスト結果によって決まります。
2. 全細胞パッチクランプ録音
- レーザー走査型2光子顕微鏡の対物レンズの下(倍率40倍、開口数0.8)の下に配置された浴槽に海馬スライスをセットします。30〜32°Cで2.5〜3mL / minの速度で加熱した酸素化ACSF-Normalで浴を継続的に灌流します。
- 赤外微分干渉コントラスト(IR-DIC)またはDodt-SGC顕微鏡を使用して、サイズ、形状、および位置を使用して目的の細胞を見つけます。
手記：標的とするニューロン集団に応じて、トランスジェニックマウスモデルを使用して、目的の細胞を簡単に見つけることができます。この場合、このステップは蛍光光源を使用して代用できます。 - 刺激ピペットに、赤色蛍光色素を含むACSF-Normal溶液(Alexa-594など)を充填します。
- 刺激ピペット(電気刺激ユニットに接続)をスライスの上にセットし、先端が目的の細胞と同じ領域にくるようにします。
- パッチピペットにパッチ溶液を充填し、ヘッドステージに取り付けた後、その先端が目的の細胞の真上にくるようにスライスの上に置きます。
- 注射器を三方ストップコックに取り付け、プラスチックチューブを介してパッチピペットに接続します。シリンジを使用して、パッチピペット(≈ 0.1 mL)に一定の陽圧を注入します。ストップコックを「閉じる」位置に保ちます。
- アンプ制御ソフトウェアモジュールをアクティブにし、「VC」ボタンをクリックして電圧クランプモードに切り替えます。電気生理学的信号を取得するための電気生理学データ収集ソフトウェア(clampexなど)を開き、「Membrane Test」アイコンをクリックして、ピペット抵抗の変化を監視するために必要な方形電圧パルス(5 mV、10 ms)を連続的に送信します。
- パッチピペットを、標的細胞の真上に来るまで下げます。細胞膜に接触したら、ストップコックを「開」位置に回して圧力を取り除きます><。 手記：細胞膜との接触は、ピペット抵抗のわずかな増加(≈0.2MΩ)が見られ、細胞の小さなくぼみが正圧によって引き起こされたときに検出されます。
- ソフトウェアによって提供されるピペット抵抗が1GΩに達するまで、ストップコックに取り付けられた空のシリンジを使用して、パッチピペットにわずかな負圧を加えます。データ収集ソフトウェアの「Membrane Test」ウィンドウで、セルを-60 mVにクランプします。
- セルが開き、セル全体の構成が達成されるまで、負圧を加え続けます。この細胞状態の検出は、ピペット抵抗の突然の変化(介在ニューロンのタイプに応じて1GΩから70-500MΩまで)と、「膜試験」ウィンドウでの大きな容量性過渡現象の出現に基づいています。
3. 二光子カルシウム(Ca2+)イメージング
- 興奮性シナプス後応答に興味がある場合は、GABAA受容体遮断薬ガバジン(10μM)とGABAB受容体遮断薬CGP55845(2μM)をACSF浴に加えます。
- アンプ制御ソフトウェアモジュールで、「CC」ボタンをクリックしてパッチ構成を電流クランプに設定し、脱分極電流(0.8-1.0 nA、1秒)の体細胞注入に応じたセルの発火パターンを記録します。パッチ溶液に存在するインジケーターがセルに入力されるまで、少なくとも 30 分待ちます。
手記： 細胞の発火パターンと活性特性を使用して、そのサブタイプ(例:高速スパイク細胞)を同定できます。カルシウム過渡現象(CaT)の記録を開始する前に、インジケーター濃度が拡散によって安定することが重要です(トラブルシューティングについては表2を参照)。 - AP誘発CaTs
- 画像取得ソフトウェアを使用して、画像の取得を開始します。赤色蛍光シグナルを使用して目的の樹状突起を特定します。目に見える応答を確保するには、まず、GABA作動性介在ニューロンではAPバックプロパゲーションの効率が距離とともに大幅に低下する可能性があるため、近位樹状突起(≤ 50 μm)を選択します。
- 画像取得ソフトウェアの「長方形ツール」を使用して、対象領域を拡大し、「xt」(ラインスキャン)モードに切り替えます。スキャンを目的の樹状突起枝全体に配置します。アクイジションソフトウェアのレーザー強度コントローラーを使用して、2光子レーザーをベースラインの緑色蛍光がわずかに見える最小出力レベルに設定し、光毒性を回避します。
- 電気生理学データ収集ソフトウェア「プロトコル」ウィンドウと画像取得ソフトウェアで、所望の振幅の体細胞電流注入を含む所望の期間の記録試行を作成します。
- 画像取得ソフトウェアを使用して、「記録開始」ボタンをクリックし、蛍光を1〜2秒間連続して取得し、画像取得を3〜10回繰り返します。光による損傷を避けるために、1回のスキャンの間に少なくとも30秒待ちます。樹状突起に沿った複数のポイントでラインスキャンを取得する場合は、順序の影響を避けるためにランダムな順序で取得します。
- シナプス誘発CaT
- 赤色蛍光シグナルを使用して目的の樹状突起を特定します。
- 目的の樹状突起の上のスライスの表面に刺激ピペットをセットします。刺激ピペットをゆっくりと所定の位置に下げ、動きを最小限に抑えて、細胞全体の構成を乱さないようにします。ピペットを樹状突起から10〜15μmの位置に配置します。
- 棘状樹状突起のシナプスマイクロドメインの位置を視覚化するには、画像取得ソフトウェアで「xt」(ラインスキャン)モードに切り替え、対象の樹状突起枝に沿って線を配置します。
- 「プロトコル」ウィンドウ(電気生理学データ収集ソフトウェア)および画像取得ソフトウェアで、試験開始後に刺激ユニットをトリガーする記録試行を作成します。
- 取得ソフトウェアを使用して、「記録開始」ボタンをクリックして、樹状突起に沿って1〜2秒間連続してスキャンします。取得を3〜5回繰り返し、スキャン間で30秒待って光損傷を防ぎます。
手記： スキャンの長さは、誘発されたイベントの動力学に応じて調整できますが、光損傷を防ぐために最小限に抑える必要があります(トラブルシューティングについては表2を参照)。 - 対処する特定の問題に応じて、さまざまな条件(例:刺激の強度/長さの違い、薬理学的ブロッカーの導入など)でステップ3.4.5を繰り返します。
- 細胞が健康状態の悪化の兆候を示している場合は、取得を停止します:-45 mV未満の脱分極、ベースラインのCa2+レベルの増加、樹状突起の形態学的劣化(例:ブレブ、フラグメンテーション;トラブルシューティングについては表2を参照)。
- 細胞の形態に関する予備情報を取得し、刺激ピペットの位置を記録するには、赤チャネルの細胞のZスタックを取得します。取得ソフトウェアを「xyz」モードで使用すると、スタックの上限と下限を設定し、すべてのプロセスを含むセル全体をイメージングします。「ステップサイズ」を1μmに設定し、「Start record」ボタンを使用してスタック取得を開始します。
- Zスタックの取得が完了したら、ソフトウェアの「最大投影」オプションを使用して、スタックのすべての焦点計画を重ね合わせ、取得の品質を確認します。次に、パッチピペットをゆっくりとスライスから引っ込めます。
- 事後形態学的同定のためにスライスを固定するには、平らなペイントブラシを使用してスライスをバスからすばやく取り出し、ACSFで満たされたペトリ皿の2つの濾紙の間に置きます。ACSFを4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液と交換し、皿を4°Cの部屋または冷蔵庫に一晩置いておきます。
表1:ソリューションレシピ。 プロトコール中に使用される溶液の化合物と濃度。
の 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名| 解決 | コンポーネント | 濃度(mM) |
| ACSF-ノーマル | NaCl | 124 |
| KClの | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-リカバリー | NaCl | 124 |
| KClの | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-ショ糖 | KClの | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| 蔗糖 | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+ベースのパッチソリューション | K+-グルコン酸 | 130 |
| ヘープス | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| ホスホクレアチンジ(トリス)塩 | 10 | |
| ATPトリス | 2 | |
| GTPトリス | 0.2 | |
| ビオシチン | 72 | |
| アレクサ-594 | 0.02 | |
| オレゴングリーン-BAPTA-1 | 0.2 |
>表 2: トラブルシューティング テーブル。 Ca2+イメージング実験中に発生する可能性のある一般的な問題の解決策。
しています| 問題 | 解決 |
| 健康なニューロンにパッチを当てることができない | スライスが健康でない兆候がないか確認します:細胞の縮小または腫れ、目に見える核など。その場合は、スライスを破棄します。また、パッチピペットの抵抗とパッチ溶液の浸透圧も確認します。値が適切な範囲にない場合は、それらを置き換えます。 |
| 樹状突起からの蛍光シグナルは低いです | セルがいっぱいになるまで、もう少し待ちます。障害物がパッチ溶液の細胞内への拡散を妨げている場合は、パッチピペットに少量の陰圧を加えてみてください。 |
| 電気刺激がCa2+反応を引き起こさない | 電気生理学的記録にアーティファクトが存在するかどうかを確認します。ない場合は、短絡/刺激ユニットの誤動作がないか確認してください。存在する場合は、刺激強度を上げるか、刺激ピペットを樹状突起に近づけます。シナプス応答を研究するときに樹状突起の直接的な脱分極を防ぐために、刺激電極と樹状突起との間の距離は8μmを超えてはならないことに留意すべきである。 |
| 誘発されたCa2+信号が高すぎる/Ca2+インジケーターを飽和させる | レーザー出力を下げます。問題が複数のセルで解決しない場合は、Ca2+ アフィニティーが低い別の Ca2+ インジケーターを使用します。 |
| ベースラインのCa2+シグナルは、実験中に徐々に増加しています | 個々のスキャンの間隔を長くします。ベースラインがまだ増加している場合は、集録を停止します。これは、細胞の健康状態が低下している可能性が高いことを示しています。 |
| Ca2+信号の振幅はスキャン中に減少します | レーザー出力を下げるか、ズームアウトします(該当する場合)。 |
| デンドライトはスキャン後に断片化(「ブレブ」)しています | レーザー出力を下げるか、ズームアウトします。ブレブが対象の樹状突起に限定されている場合は、別の樹状突起を選択し、レーザー出力を下げるかズームアウトします。複数の樹状突起がブレッドしている場合は、取得を停止します。 |
| 蛍光シグナルは、スイープ後にスキャンラインから「ドリフト」 | ACSF 灌流の速度を下げて、スライス内の動きを減らします。パッチを適用する前に、スライスがネットでしっかりと固定されていることを確認してください。 |
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物系統:マウスCD1 | チャールズ川 | 22 | |
| 塩化カルシウム | シグマ・アルドリッチ | C4901 | |
| D-(+)-グルコース | シグマ・アルドリッチ | G8270 | |
| ヘープス | シグマ・アルドリッチ | H3375-J | |
| 塩化マグネシウム | シグマ・アルドリッチ | M8266 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | シグマ・アルドリッチ | 230391 | |
| パラホルムアルデヒド粉末、95% | シグマ・アルドリッチ | 158127 | |
| 塩化カリウム | シグマ・アルドリッチ | P3911 | |
| グルコン酸カリウム | シグマ・アルドリッチ | P1847 | |
| アジ化ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S2002 | |
| 炭酸水素ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S8875 | |
| 塩化ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S5886 | |
| 蔗糖 | シグマ・アルドリッチ | S9378 | |
| トリトンX-100 | シグマ・アルドリッチ | T9284 | |
| トリズマベース | シグマ・アルドリッチ | T1503 | |
| トリズマ塩酸塩 | シグマ・アルドリッチ | T3253 | |
| リン酸ナトリウム二塩基性二水和物 | シグマ・アルドリッチ | 71643 | |
| リン酸ナトリウム一塩基性 一水 和物 | シグマ・アルドリッチ | S9638 | |
| ビオシチン | シグマ・アルドリッチ | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 ヒドラジド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A10438 (英語) | |
| SR95531(ギャバジン) | アブカム | ab120042 | |
| アデノシン三リン酸(ATP)-トリス | シグマ・アルドリッチ | A9062の | |
| グアノシン(GTP)-Na+ | シグマ・アルドリッチ | G8877 | |
| オレゴングリーンBAPTA-1 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | O6812 | |
| ホスホクレアチンジ(トリス)塩 | シグマ・アルドリッチ | P1937 | |
| ストレプトアビジン結合Alexa-546 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11225 | |
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