ラット脳における電気生理学的記録による薬物マイクロインジェクション

要約

出典:Lai, J., et al.げっ歯類の脳における阻害剤の電気生理学的記録と微量注射の同時実施。J. Vis. Exp.(2015年)

このプロトコルは、麻酔をかけたラットの標的脳領域への正確な薬物送達のための注射器の組み立てと使用を概説し、続いて記録された電気信号によるニューロン活動のモニタリングを行います。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 記録注入ピペットの組み立て

1. ピペットプーラーを使用して、長さ約7cmのガラスキャピラリー(外径1mm)を引っ張ります。
2. 毛細管の先端を壊し、光学顕微鏡で絞りを確認します。内径が30μmから40μmの間であることを確認してください。
3. ガラスピペットの先細りでない端から約1cm突き出た長さ7cmの銀線をガラスキャピラリーに挿入します。
4. 余分なフィラメントをガラスキャピラリーに対して直角に曲げます。
5. 30Gの皮下注射針のシャフトに柔軟なプラスチック接着剤の液滴を塗布します。
6. 図1に示す概略図に従って、30Gの皮下注射針をガラスピペットに挿入します。
7. ガラスピペットと皮下注射針の間の接合部から適切に密閉されるように、2番目の接着剤コーティングを追加します。
8. ピペットを先端を上に向けて約12時間乾燥させ、接着剤が適切に硬化することを確認します。最終的な結果を図 2 に示します。

>注:この手順は急性実験で行われ、ピペットチップの滅菌は必要ありません。

2. 動物の調理法

1. ラットを麻酔ボックスに入れます。
2. 4%イソフルランを使用して5〜10分間麻酔を誘発します。
3. 動物を温熱パッドと直腸プローブを備えた定位固定装置台に置き、体温を37°Cに保ちます。麻酔を維持するために、2%イソフルランを含むノーズコーンを使用します。耳棒と歯ホルダーを使用してラットの頭を固定します。
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4. %アトロピン点眼薬を含む眼科用軟膏または点眼薬を塗布して、 ?? 孔の拡張を助けます。.乾燥を防ぐため、約30分おきに潤滑液を塗布してください。
5. 頭を剃り、10%ポビドンヨードできれいにします。
6. 局所麻酔の場合は、皮膚を持ち上げて針の先端を挿入することにより、0.5mlの2%リドカインを頭皮の下に2〜3か所注入します。
7. つま先をつまんで動かない様子を観察し、適切な麻酔レベルを確認します。さらに、心拍数が正常値(300〜400拍/分)内にあることを確認するために、心拍数を監視する必要があります。
8. #10メスの刃で中央値に沿って頭皮を直線的に切開し、冠状縫合糸と矢状縫合糸の両方を露出させます。
9. 頭蓋骨を覆っている組織を手術用ヘラで脇に押して、ラムダとブレグマのポイントを明らかにします。
10. 頭蓋骨を水平にして、ブレグマとラムダの位置が同じ平面上にくるようにします。
11. 基準点を設定するには、ガラス管が取り付けられた定位固定装置を使用して、Bregmaの真上に設定します。これは、前後および内側外側の測定座標の「ゼロ」になります。
12. 定位固定装置マウントを必要な座標に移動して関心点を設定し、定位固定装置の座標をメモし、開頭術が行われる場所を示すターゲット領域の周りに正方形を描きます。
13. マークされた正方形に沿って滅菌されたドリルを備えた外科用ドリルを使用して、骨材料を圧力をかけずにゆっくりと取り除きます。同じ領域で長時間ドリルを開けすぎると、熱が発生して皮質に病変が生じるため、注意してください。
14. 開頭術を区切る骨が十分に薄くなったら、ピンセットで頭蓋部分を慎重に取り除き、皮質を露出させます。
15. 組織の乾燥を防ぐために、露出した皮質を人工脳脊髄液で頻繁に洗浄します.
    手記： ラットでは硬膜除去は不要で、注入液の先端は貫通するほど頑丈です。

>3. インジェクションシステムの充填と取り付け

1. 5-10 μLのマイクロシリンジに吸引して鉱物油を充填します。
2. 0.5% シカゴ スカイ ブルー (CSB) と 300 μM γ-アミノ酪酸 (GABA) の溶液、または 2% リドカインと 0.5% CSB 9 の溶液を固定ガラス ピペットで皮下注射針に充填します。すべての溶液を生理食塩水で希釈します。
   1. 物質が豊富な場合は、通常の注射器を使用して充填し、気泡の形成を避けるために通常の予防技術を使用してください。
   2. より高価な物質の場合、鉱油を使用して注入器を充填し、その後、吸引によって化学薬品を導入することができます。鉱物油と水の密度差は比較的大きいため、この物質は水溶液の注入に適した候補です
      手記：染料を添加して、両方の液体間の分離を確認することができます。
3. インジェクションピペットに充填するには、1 mLのシリンジに溶液を吸引し、ゆっくりとピペットに注入します。
4. 図1に示されている領域の漏れには細心の注意を払い、これらの領域をきれいに拭き取り、シリンジで溶液をゆっくりと注入して漏れを観察します。
5. 1mlのシリンジを取り外します。その際、真空がインジェクションピペットから溶液を除去しないように、プランジャーに軽い圧力をかけてください。
6. マイクロシリンジを鉱物油で吸引し、充填したインジェクションピペットにしっかりと取り付けます。次に、組み立てたインジェクターから余分な溶液をガーゼで慎重に拭き取ります。
7. ガラスピペットの先端に小さな液滴が見える程度の非常に少量を注入し、チップが詰まっていないことを確認します。
8. インジェクターをマイクロポンプシステムに取り付け、しっかりと固定されていることを確認します。
9. インジェクターチップをターゲット座標に慎重に配置し、チップを皮質の表面まで下げます。
10. 脳定位固定装置を使用して、適切な解剖学的座標を使用して、注入を標的構造(上丘)までゆっくりと下げます。
11. 露出した皮質を温かい寒天で覆い、組織の乾燥を防ぎます。

>4. インジェクションと可逆的不活性化

1. マイクロインジェクションポンプを40 nl/minで400〜800 nlを注入するように設定し、Runを押して注入を開始します。注入中にスパイク率が低下することに注意してください.
   注:実験設定では、GABA送達終了後1時間以内に神経活動が回復しました。校正された任意の機械装置を使用して、マイクロインジェクションシリンジに圧力を加え、注射を行うことができます。
2. 電気生理学的データを取得した後、地元の動物倫理コミュニティによって承認された方法を使用して安楽死させます。

結果

図 1:インジェクロードアセンブリの概略図。記録注射ピペットにはマイクロシリンジ(A)が取り付けられており、ガラスピペット(D)内の銀線(C)に30Gの皮下注射針(B)を接着したものです。丸で囲まれた領域(E-F)は、漏れやすい可能性のある領域を示しています。

図 2:30Gの針(B)、防水接着接着剤(F)、銀線(C)、ガラスピペット(D)を使用して組み立てたピペットの写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インジェクションポンプ(UltraMicroPump III)	WPIの	#UMP3
インジェクションコンソール(Micro4コントローラー)	WPIの	#SYS-マイクロ4
ハミルトンシリンジ	ハムリトン	(80301) 701LT 10 μL SYR	5〜10μLのシリンジを使用
ゲルシアノアクリレート接着剤	クレイジーグルー	KG86648R	ゲル状は、30G皮下注射針のシャフトに塗りやすい
ガラスピペット	WPIの	#TW100F-4	薄肉、外径1mm、内径0.75mm、フィラメントピペット使用
720ニードルピペットプーラー	コップフ	720
シルバーワイヤー	A-Mシステムズ株式会社	782500	裸の0.010インチ
寒天
キャピラリーチューブ
皮下注射針
シカゴ・スカイブルー (CSB)
γ-アミノ酪酸(GABA)
リドカイン
アトロピンドロップ
イソフルラン
ヒーティングパッド
脳定位固定装置用テーブル
#10メスの刃
鉱油

です 名