マウス脳スライスにおけるGABAパフによる全細胞電流の記録

要約

出典:Feng, Y. et al., 脳スライスにおけるGABAのパフ適用によって誘発される全細胞電流。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、マウスの前頭前野皮質脳スライスにおけるγ-アミノ酪酸(GABA)によって誘発される全細胞電流の記録を示しています。GABAの制御された送達は、シナプス後ニューロンの塩化物チャネルを開き、抑制性シナプス後電流(IPSC)を生成します。これらのIPSCは、GABA濃度が高くなると増加し、シナプス伝達に対するGABAの阻害活性を反映しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 溶液の準備

1. 表 1 に記載されているように、公開された研究に記載されている成分を含む 500 mL の標準的な人工脳脊髄液 (ACSF) を準備します。
   1. 脱イオン水を含む清潔なガラスビーカーを使用して、新しいACSF溶液を調製します。塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)、リン酸二水素ナトリウム(NaH₂PO₄)、重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、硫酸マグネシウム(MgSO₄)、D-グルコースを添加する前に、脱イオン水でスパチュラを洗浄し、乾燥させてから乾燥させ、溶液を95%O₂ / 5%_CO2で泡立たせた後、塩化カルシウム(CaCl₂)を加えます500 mL の脱イオン水に ~20 分間 (表 1 に詳述) 混合します。完全に溶解するまで攪拌します。
   2. ACSFが降水量なしで完全に透明であることを確認してください。次に、pHを7.2〜7.4に調整します。95% O₂ と 5% CO₂ からなる混合ガスで ~20 分間泡
   立てます。
2. 表2に記載されている化学物質を含む250mLのスライス切断溶液を調製します。
   1. KCl、塩化マグネシウム(MgCl₂)、_NaH2PO₄、NaHCO₃、コリン・Cl、D-グルコースを添加し、1.1.1に示すように最後に塩化カルシウム(CaCl₂)を250mLの脱イオン水に加え、1.1.1および1.1.2に示すように溶解します。
   2. 95%O₂/5%CO₂で泡立った後、溶液を冷凍庫に15〜20分間入れて、切削液が氷冷し、部分的に凍結するようにします
      手記：生後1〜2か月のマウスからスライスを作成するときに、この切断ソリューションを使用します。2ヶ月以上のマウスでは、この式が異なる場合があります。
   3. リポ多糖(LPS)溶液を滅菌エンドトキシンフリーの等張生理食塩水(0.9%NaCl)に溶解して調製します。LPSは腹腔内投与(0.5 mg / kg)され、2時間後に記録を開始します。

2. 前頭前野スライスの準備

1. 切断液を冷凍庫から取り出し、均質化してスラッシュを得ます。溶液を氷の上に置き、95%O₂/5%CO₂で常に泡
立てます。
2. 大きくて鋭いハサミを使用して、説明されているようにマウスをすばやく切り落とし、すぐに頭を氷冷(0〜4°C)の切断溶液で満たされたビーカーに入れます。
3. 頭蓋骨の上部を正中線に沿って尾側から鼻の方向に細いはさみで切り取り、頭蓋骨の外側部分を取り除きます。細かいヘラで脳を取り出し、氷冷した切断液に落とします。
   手記：ステップ2.2-2.3は、迅速に(理想的には1分<)実行する必要があります。
4. 氷で満たされた9cmのシャーレの蓋に脳を置きます。氷冷した切断液で脳をすすぎます。小脳と嗅球をかみそりの刃で切り取ります。
5. シアノアクリレート接着剤をビブラトームの試料ホルダーに塗布します。吻側を上にして、ブレインブロックを接着剤の滴の上に慎重に置き、すぐに氷冷した切断液に浸します。
6. ビブラトームのブレードホルダーを水平面を基準にして15°の角度に調整し、350μmの冠状脳スライスを準備します(ブレード振動周波数= 85 Hz、速度= 0.1 mm / s)。
7. ピペットを使用して、スライスをACSFで満たされた回収チャンバーに移し、95%O₂/5%CO₂の一定のバブリングで1時間(RT)インキュベートします。

3. 全細胞パッチ録音

1. 記録電極またはパフマイクロピペットとして使用するためのガラスホウケイ酸マイクロピペットは、プーラー操作マニュアルの特定のガイドラインに従って作成します。記録電極の場合、チップ抵抗は4〜6MΩの範囲ですが、パフマイクロピペットのチップ直径は2〜5μmの範囲です。
2. Na⁺チャネルブロッカー(テトロドトキシン(TTX)、1μM)をACSFに添加し、高速Na⁺チャネルを遮断し、活動電位をACSFに添加し、記録チャンバー内でこの溶液の流量を2〜3mL/minに一定に保ちます。ACSFを95%O₂/5%CO₂で常に泡立てて、スライスの生存率を確保します。
3. スライスサイズに合わせて細い先端がカットされた改造パスツールピペットを使用して、脳スライスを記録チャンバーに移します。プラットフォーム上でスライスを保持するために、≥2 mm間隔で平行なナイロン糸を備えたプラチナスライスアンカーでスライスを覆います。
4. 記録用マイクロピペットに内部溶液(表3)を充填し、パフマイクロピペットに10 μM、50 μM、100 μM(ACSFに溶解)のγ-アミノ酪酸(GABA)を充填するか、ビヒクル制御としてACSFを充填します。
5. 破片による詰まりを防ぐため、記録電極をACSFに浸す前に、1mLシリンジを使用して軽い陽圧を加えてください。顕微鏡下でマイクロマニピュレータ(4倍対物レンズ)を使用して、記録電極とパフマイクロピペットを、先端がモニターのビデオ画像の中央に表示されるように配置します(図1A)。
6. 顕微鏡の焦点(40倍対物レンズ)を調整しながら、パフマイクロピペットを徐々に下げ、45°の角度で記録ニューロンの上に置きます。パフマイクロピペットの先端とニューロンの間の距離を20〜40μmの間に保ちます(図1B)。記録電極でゆっくりと慎重にニューロンに近づき、陽圧を解放します。電極ホルダーに接続されたチューブを通して弱く短時間の吸引を加えて、ギガオームシールを作成します。
7. 電圧を0mVに保ちます。ギガオームシールの形成後、高速および低速の静電容量を手動または自動で補正します。次に、上記のチューブを介して短時間強力に吸引し、全細胞モードに入ります。
8. eIPSCを電圧クランプモードで記録します。Master 8電圧ステップジェネレータによって制御されるピコスプリッツァーを使用して、パフマイクロピペットに低ガス圧(窒素、4 - 6 psi)を印加し、シングルまたはペアのGABAパフを送達します(図2)。

>表 1.ACSFの記録。

の 名 名 銭

実体	グラム/モル	濃度(mM)	重量(g / L)
NaCl	58.443	119	6.9547
KClの	74.551	2.5	0.1864
NaH2PO4	137円99銭	1	0.1380
NaHCO3	84.007	26.2	2010年2月
MgSO4	120.366	1.3	0.1565
D-グルコース	198円17銭	11	1799年
CaCl2	110円98	2.5	0.2775

>表 2.スライス切断ソリューション。

銭 名 名 名 名 銭

実体	グラム/モル	濃度(mM)	重量(g / L)
KClの	74.551	2.5	0.1864
MgCl2	95円211	7	0.6665
NaH2PO4	137円99銭	1.25	0.1725
NaHCO3	84.007	25	2.1002
コリン・Cl	139.63	115	16.0575
D-グルコース	198円17銭	7	1.3872
CaCl2	110円98	0.5	0.0555

>表 3.全細胞パッチ記録用の内部ソリューション。

名 銭 名 銭 年 銭 名 年

実体	グラム/モル	濃度(mM)	重量(g / L)
Csグルコン酸	328.052	100	32.8052
セシCl	168円36	5	0.8418
ヘープス	238.301	10	2.3830
MgCl2	95円211	2	0.1904
CaCl2	110円98	1	0.1110
バプタ	476.433	11	5.2408
Na2ATP	551.1	4	2044
ナ2GTP	523.2	0.4	0.2093

結果

図 1.パフマイクロピペットと記録電極の図
(A)パフと記録用マイクロピペットの間の距離。 (イ) 脳切片の表面にあるパフマイクロピペット(左)と記録電極(右)。

図 2.GABAパフによるIPSCのピクロトキシン遮断
(ア) (B) 50 μM GABAをパフすると、TTX(1 μM)、CNQX(20 μM)、AP5(50 μM)を含むACS...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラスホウケイ酸マイクロピペット	シャッター計器	BF150-86から10	外径1.50 mm、内径0.86 mm
マイクロピペットプーラー	シャッター計器	モデルP-97	フレーミング/ブロウマイクロピペットプーラー
マイクロマニピュレーター	シャッター計器	MP-285
コンピュータ制御のアンプ	分子デバイス	マルチクランプ700B
デジタルアクイジションシステム	分子デバイス	デジデータ 1440A
イメージングカメラ	ニコン	2115001	検査機器
顕微鏡	ニコン	エクリプスFN1
マスター8	A.M.P.I.	Master-8パルス刺激装置
ビブラートームスライサー	ライカ	VT1000S(バート1000S)
Picospritzer	パーカー・ハネフィン		細胞研究におけるピコリットル体積の排出のための圧力システム
カミソリの刃	ジレット	74-S	フライングイーグル
ビデオモニター	パナソニック	WV-BMの1410
502 グルー	デリ	7146	シアノアクリレート接着剤
蠕動ポンプ	上海ジアペン株式会社	BT100-1F
ビデオカメラ	オリンパスアメリカメディカル	オリ-150
トランスファーピペット	バイオロジックス	〒30-0138A1

名