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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>1. 外部および内部ソリューション
- 哺乳類のリンガー溶液は、網膜解剖中およびその後の電気生理学的記録の外部溶液として使用します。.記録日に10倍ストック溶液(カルシウムなし)から哺乳類のリンゲル溶液を調製し、15分間のカーボジン化(95%O2および5%CO2)後にCaCl2を滴下します。最終的な1x溶液は、120 NaCl、5 KCl、25 NaHCO3、0.8 Na2HPO4、0.1 NaH2PO4、2 CaCl2、1 MgSO4および10 D-グルコースを含む(mM単位)。
- 2つの内部ソリューションを使用して、SAC振動を特性評価します。成体マウス網膜神経節細胞(RGC)に長時間の全細胞パッチクランプ記録で調製した溶液の有用性をテストし、検証されたバッチを-20°Cで500μlアリコートに保管します。
- 膜電位振動の記録には、125 K-グルコン酸、8 NaCl、4 アデノシン三リン酸(ATP)-Mg、0.5 Li-グアノシン三リン酸(GTP)、5 エチレングリコール四酢酸(EGTA)、10 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、0.2% バイオシチン(w/v)を含むカリウムベースの内部溶液を使用します。KOHでpHを7.3に調整します。
- 興奮性および抑制性のシナプス後電流を記録するには、100 Cs-メタンスルホン酸、8 NaCl、4 ATP-Mg、0.5 Li-GTP、5 EGTA、10 HEPES、0.2% biocytin (w/v) を含む (mM 単位) セシウムベースの内部溶液を使用します。CsOHでpHを7.3に調整します。
2. 収録当日の準備
- 穴が開いたニトロセルロースメンブレンを調製するには、鈍い16Gシリンジ針から作られたカスタマイズされたパンチャーでメンブレンを手動でパンチし、2つのきれいなガラスプレートの間にメンブレンを平らにします。ホールマウント網膜の場合は、直径0.2 mmの中央に穴を開け、直径1〜1.2 mmの大きな穴を4つ囲みます。
- 内部溶液を電極に装填するためのカスタマイズされたバックフィルフィラメントを作成するには、10 μlのピペットチップを中央で溶かし、溶けた部分が冷えて固まるまでゆっくりと伸ばします。使用直前に、清潔なカミソリの刃を使用して、パッチピペットよりわずかに長くなるまでフィラメントをトリミングします。
- プログラム可能なプーラーで、内部フィラメントを備えたホウケイ酸ガラス管からパッチピペットを引き抜きます。実験当日にマイクロピペットを製作し、すぐに使用してください
手記： SACの記録には、次のプーラー設定を使用します:熱:484;プル:0;速度:25;遅延時間:1;圧力: 400 で、ランプ値は 462 です。ホウケイ酸チューブの外径(O.D.)と内径(I.D.)は、それぞれ1.65mmと1.0mmです。ピペットの抵抗は10-14MΩです。
- ティッシュ採取の1時間前に、内部溶液のチューブを渦の上で>30分間振って解凍します。
3. 網膜解剖
- 動物がつま先のつま先つまみに対する反応性を失うまで、酸素中の4%イソフルランで動物を麻酔します。頸椎脱臼によって動物を犠牲にします。
- 視神経頭から1〜2 mm離れたところにある両眼球を、まっすぐに尖った虹彩はさみで視神経から切り取ります。
- 清潔なペーパータオルの上で眼球を転がして血液を取り除き、炭水化物化哺乳類のリンガー溶液に浸します。23Gの針でリンバスに穴を開け、マイクロハサミでリンバスに沿って切って眼球を二等分します。細い鉗子を使用して角膜と水晶体を取り除きます。
- 網膜ホールマウントの場合、細かい鉗子で色素沈着した上皮から網膜全体をそっと剥がし、端から視神経頭に向かって1.5〜2mmの直交する切り込みを4回行います。
- パンチングされたニトロセルロースメンブレンを皿に浸し、神経節細胞層(GCL)側を上にして網膜をそっとドラッグします。ホールマウント網膜を準備するときは、視神経ヘッドを中央の穴に配置します。網膜のあるメンブレンを別のきれいな皿に移します。細いペイントブラシで網膜をやさしく平らにしてマルチーズクロスのように見せ、穴の上に4つの端をすべて置きます。
- 網膜の一部を一度に検査する場合は、ステップ3.3で準備した各アイカップを、色素沈着した上皮を取り付けたままかみそりの刃で3〜4個に切断します。未使用のピースをカルボジン化外部溶液で光から保護し、12時間以内に使用してください。
- ニトロセルロースメンブレンを乾燥した濾紙で拭き取り、鉗子子とペイントブラシで硝子体と内側の制限膜を取り除きます。
- 下部に密封されたガラスカバースリップを使用してアセンブリを記録チャンバーに移す前に、すべての網膜エッジがメンブレンに完全に取り付けられていることを確認してください。真空グリースでメンブレンをカバースリップに固定し、網膜を外部溶液で再水和します。アセンブリの下に気泡が溜まらないように注意してください。
- チャンバーを正立顕微鏡のステージにセットします。温かい(34-35°C)カルボジン化外部溶液をチャンバーに灌流し、毎分~3mlの速度で行います。
- 最初に10倍の対物レンズで網膜を検査し、次に60倍の水浸レンズを使用して、微分干渉コントラスト(DIC)および/または落射蛍光の下でGCLおよび内核層(INL)ニューロンを確認します。tdTomatoを発現するSACを可視化するには、白色発光ダイオード(LED)光源と励起フィルタ554nm、蛍光フィルタ581nmを組み合わせて使用します。
4. フラットマウントRetinaからの全細胞パッチクランプ記録
- シリンジフィルターを介して内部溶液をカスタムバックフィルフィラメントにろ過します。
- フィラメントを引っ張りたばかりのマイクロピペットに挿入し、溶液が銀色の電極ワイヤーを>5mm覆うまで先端近くの内部溶液を分注します。マイクロピペットを吸引ポール付きの電極ホルダーに固定し、チューブに接続された10mlプラスチックシリンジのプランジャーを押すか引くことで電極内の圧力を調整できます。
- 対物レンズの下にあるピペットを見つけ、網膜から~100μm上まで下げます。電流フォロワモード(I = 0)では、DCオフセットを使用して定常DC電圧信号をゼロにします。電流クランプ(IClamp)モードで、ピペットが浴中にある間に固定振幅の方形波電流を注入してピペット抵抗を測定し、Raccessノブを回して差を中和します。Raccessノブの読み取り値を使用して、オームの法則によるピペット抵抗を計算します。
- 電極を網膜から~10μm上までゆっくりと近づけます。電極に正圧を加えます。ピペットチップ付近の反射が網膜に近づくにつれて変化するのを観察してください。ピペットをGCLに素早く、しかし穏やかに押し込み、すぐに正圧を下げます。
- ピペットを標識されたニューロンに向かって動かします。他のニューロン、血管、Muller細胞の端足に接触しないようにしてください。電極の目詰まりを防ぐために、必要に応じてより多くの正圧を加えます。
- ピペットの先端を標識されたニューロンの正中線の近くに置き、くぼみが見えるまで待ちます。陽圧を緩め、原形質膜がピペットチップに跳ね返るのを待ちます。
- ピペットに20〜120pAの負電流を印加して、ギガオームシールの形成を助けます。必要に応じて、原形質膜をピペットに引き込むために、穏やかに吸引します。シール形成後5分待って細胞膜を破裂させます。これにより、こぼれた内部溶液をスーパーフュージョンによってクリアすることができます。穏やかに吸引して膜を破裂させます。
- メンブレンが破裂した後、電流クランプモードになっている間に、ブリッジバランスをオンにし、Raccessノブを使用して調整します><。
手記：SAC のような小さなセルの場合、わずかな調整が必要であっても、必要なだけです。あるいは、セルを塩化物(約-75mV)とグルタミン酸(約0mV)の反転電位にそれぞれ保持することにより、電圧クランプモード(Vクランプ)で興奮性および抑制性のシナプス後電流を記録します。必要に応じてピペットの位置を確認し、調整して、時折発生する網膜やマイクロマニピュレーターのドリフトに対応します。
- 薬理学的治療前、薬理学的治療中、および治療後の膜電位または電流変化を記録するには、シナプス遮断薬(例:シアンキキサリン[CNQX]、(2R)-アミノ-5-ホスホノペンタノエート[AP5]、ピクロトキシン、ツボクラリンなど)およびチャネルモジュレーター(例:フルピルチン、ドーパミン、メクロフェナム酸など)を実験日に凍結ストックから新鮮に調製します。薬物をカルボゲン化リンゲル溶液で希釈します。.灌流によってバッチ方式でそれらを適用します。
- 録音後、ピペットを体細胞からそっと取り外します。アセンブリをチャンバーから清潔な皿に移します。網膜を穿孔されていない別の平坦なニトロセルロース膜に取り外して再度取り付け、固定中の網膜の平坦性を確保します。