共培養脊髄切片におけるニューロン再生を評価するための電気生理学的記録

要約

出典:Heidemann, M., et al. Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2015年)。

このビデオは、多電極アレイまたはMEAデバイスを使用してキャプチャされた、脊髄切片の器官型共培養からの電気生理学的記録を示しています。これらの記録は、スライス間のニューロン再生を評価します。観察された同期した電気的活動は、神経再生の成功を裏付けています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. MEAへの脊髄組織切片の取り付け

1. インキュベーター内の滅菌栄養培地を温めます(37°C、酸素化のために蓋を軽く緩めます)。
2. 電極アレイに焦点が合った状態で、ペトリ皿内の室温(RT)で、先端がゴムで覆われた滅菌ピンセットを使用して、多電極アレイまたはMEAを実体顕微鏡で配置します。6 μlのニワトリ血漿液滴を、清潔でほこりのない滅菌電極アレイの中央に配置します。小さなヘラを使用して、腹側が互いに向き合うように2つの脊髄部分を血漿液滴に慎重にスライドさせます。へらで電極に触れないでください。
3. ニワトリの血漿液滴の周囲に8 μlのトロンビンを加えます。トロンビンピペットの先端を使用して、チキンプラズマ/トロンビン混合物を2つのスライスの周りに慎重に混合して広げます。繰り返しになりますが、脆性電極アレイに直接触れないでください。凝固の直前に、余分な鶏の血漿/トロンビンを吸引します。.
4. シャーレに蓋をして高湿度を保ち、MEA/培養アセンブリをインキュベーター内の加湿チャンバーに約1時間置いて37°Cにします。
5. 10 μlの栄養培地を培養チャンバーに慎重に加え、シャーレに蓋をして、インキュベーターに約30分間戻します。
6. 滅菌されたゴムで覆われた先端を備えた各MEA/培養アセンブリをローラーチューブに入れ、3 mlの栄養培地を加え、蓋をしっかりと閉めます。ローラーチューブをローラードラムに入れ、インキュベーター内で1〜2rpmで回転させ、37°Cの5%CO₂含有雰囲気で
回転させます。
7. in vitro(DIV)で7日後、その後は週に1〜2回、栄養培地の半分を交換します。

2. 機械的病変

1. 無菌のゴムで覆われた先端を持つMEA/培養アセンブリをローラーチューブから取り出し、組織に焦点が合った状態で実体顕微鏡下で栄養培地を含まないペトリ皿に入れます。2 つのスライスが融合していることを視覚的に確認します。
2. MEAにゴムで覆われた先端のピンセットを配置して、MEA /培養アセンブリをしっかりと保持します。
3. 組織スライスに近いMEAの溝にメスの刃を置きます。メスをかなり水平に持ちます。
4. メスのハンドルを持ち上げますが、メスの刃をMEAの溝に留まらせて、ブレードがベースからチップに「転がり」、それによって溝を覆う組織を切り裂くようにします。
5. 必要に応じて、25Gの針先で残留組織の接続を厳しくします。溝の内側の領域でのみ作業し、柔らかいエッジに触れないでください。
6. MEA /培養アセンブリをローラーチューブに戻します。3 mlの新鮮な栄養培地を培養物に供給し、インキュベーターのローラードラムに戻します。

3. 自発的活動の電気生理学的記録

1. 選択したDIV数後の2つの脊髄スライス間の機能再生を調べるには、MEA/培養アセンブリを顕微鏡の記録チャンバーにマウントし、約500μlの細胞外溶液を適用します(材料リストを参照)。
2. 最初の録音の前に10分待って、システムが安定するまで待ちます。
3. RTでMEAの各活動検出電極から約10分間、基本的な自発的な活動を2回記録します。
4. 細胞外条件を安定させるには、記録セッションのたびに細胞外溶液を交換してください。
5. ネットワークを脱阻害するには、ストリキニーネ(1 μM)とガバジン(10 μM)を含む細胞外溶液を塗布します。少なくとも2分間待ってから記録を開始します。

4. データ分析

>注:細胞外に記録された活動電位の検出には、標準偏差に基づく検出器と各電極の後続の識別器を使用してください。

1. 各電極の検出されたニューロン活動を、標準的な手順に従ってラスタープロットに表示します(図1F)。
2. 10ミリ秒のスライディングウィンドウ内の適切なチャネルのイベント数を1ミリ秒ステップシフトして要約することにより、各スライスの合計ネットワークアクティビティを決定して表示します(図1G)。
3. 各スライスで個々のバースト(複数の電極に現れる活動のクラスター)を検出します。したがって、対応する合計ネットワーク アクティビティの最小ピーク アクティビティしきい値を設定し、各バースト開始とバースト終了を定義します。たとえば、適切なしきい値は平均バースト振幅の 25% であり、バースト開始は少なくとも 5 ミリ秒の時間枠の最初のイベントとして定義でき、バースト終了は少なくとも 25 ミリ秒の時間枠の最後のイベントとして定義できます。
4. 機能再生を定量化するには、2 つのスライス間で同期バーストの割合を計算します。これを行うには、1 つのスライスのバーストと他のスライスの次のバーストとの間の待機時間を計算します。
   手記：バーストペアは、レイテンシが平均バースト長よりも小さい場合に「同期」と呼ばれます。特に、アクティビティの多い共文化では、選択した遅延ウィンドウで両側が偶然にバーストを開始する可能性があります。この事実は、同期バーストの割合を定量化する際に考慮する必要があります。

結果

図 1.自発的な活動の表示と分析。(A)MEAの図。プラチナで覆われた電極は黒で、透明なワイヤーは赤で、MEAの中央の溝は黄色で描かれています。(B)MEAの中央に位置する電極アレイのクローズアップ。(C)8 DIVの古い文化の明視野画像。スライスは成長し、向かい合う側面に沿って融合しています。黄色のバーは、MEAの電極および絶縁のない溝を表しています。スケールバー = 400 μm (D) 実験のタイムライン。E14ラット胚の2つの脊髄スライスをMEA上に隣接して配置します。数日以内に、スライスは成長し、向かい合った側面に沿って融合します。8 - 28 DIV の時間枠で、完全な病変は融合部位を通じて行われます。2〜3週間後、自発的な活動が記録され、培養物は免疫組織化学的染色のために固定されます。(E)23 DIV古い培養物の各個々の電極の自発的な活動の痕跡。より明確に視覚化するために、2 秒...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
平面多電極アレイ	クワネバイオサイエンス		私たちの研究室のデザインに従ってカスタムメイド
栄養培地			100mlの場合
ダルベッコス修正イーグルの媒体	ギブコ	31966-021	80ミリリットル
馬の美容液	ギブコ	26050-070	10ミリリットル
蒸留水, 滅菌水			10ミリリットル
神経成長因子-7S [5ng/mL]	シグマ・アルドリッチ	N0513	200μl
			1% BSAを含む洗浄液で再構成
細胞外マトリックスゲル	BDバイオサイエンス	356230	常に冷たく保つ必要があります。出生前および胚のニューロンに最適化された培地で 1:50 に希釈
細胞外液(pH 7.4)			[mM]
NaCl			145
KClの			4
MgCl2			1
CaCl2			2
ヘープス			5
Na-ピルビン酸			2
グルコース			5
ガバジン	シグマ・アルドリッチ	SR-95531
マイクロピペット	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	MF28G-5
ストリキニーネ	シグマ・アルドリッチ	S0532	毒性
組織培養フラットチューブ10(=ローラーチューブ)	テクノプラスチックプロダクツAG	91243

します。 の 名 の シリーズ