一次元パターン化した神経細胞培養の外部興奮

要約

出典:Stern, S., et al. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、一様で一方向の電場でラインパターンのニューロン培養を刺激する技術を示しています。

プロトコル

1. 蛍光色素によるニューロン培養における自発的または誘発的な活動のイメージング。

1. 50 μL DMSO(ジメチルスルホキシド)に50 μgのカルシウム感受性蛍光色素(材料/試薬の表を参照)の溶液を調製します。
2. 10 HEPES、4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、139 NaCl、10 D-グルコース、45スクロース(pH 7.4)を含む細胞外記録溶液(EM)を調製します。
3. 2 mLのEMでニューロン培養物を8 μLのカルシウム感受性蛍光色素溶液と1時間インキュベートします。光から保護し、ゆっくりと回転させて、色素が細胞に均一に広がるようにします。
4. イメージングする前に、溶液を新しいEMと交換してください。蛍光イメージングを図1に示します。
5. 顕微鏡の視野内の任意の関心領域(ROI)の強度を定量化できるカメラとソフトウェアを使用して、カルシウム蛍光イメージング用の光学フィルターを備えた蛍光顕微鏡(励起ピーク488nm、発光ピーク520nm)で画像化します。

2. 文化の電気刺激

>注:電気刺激の基本的な設定を図2に示します。神経細胞培養物を約14日間培養したカバースリップをペトリ皿に蛍光顕微鏡で入れます。ニューロンの電気的活動は、カルシウム感受性色素を使用して画像化され、培養物の外側に配置された2対の浴電極を介して電圧が印加されます。電極は信号発生器によって駆動され、その出力はデュアルチャネルアンプによって増幅されます。刺激の電圧制御は、電界ベクトルが直接決定されるため、ベクトルの追加と組み合わせが簡単に行えるため、より標準的な電流制御よりも好まれます。これには、電界の均一性を慎重にチェックする必要がありますが、電圧制御の場合、サンプル全体に対して実行できます。電圧制御を使用する場合は、グランドループを避けるように注意し、電界の均一性を確認する必要があります。

1. 均一な電界による電気刺激には、一対の平行電極ワイヤを使用します。
   1. 厚さが0.005インチ(127μm)のオーダーの白金製の電極を使用してください。13 mmのカバーガラスと一緒に使用する場合は、2つの電極間の距離が約11 mmであることを確認し、電極を培養物の1 mm上に配置します
      注意: 電極ホルダー(図3A)を作成するには、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)を使用します。PTFEに細い穴を開けて電極を挿入します。デバイスは、電極が露出している上端が溶液と接触しないように、細胞外溶液よりも高くする必要があります。絶縁には、電極リード線の露出する可能性のある部分にエポキシ接着剤を使用します。
   2. 電解を避けるためにDC部品を含まない、デューティサイクルが50%の矩形パルス形状を使用してください。パルス持続時間を10μsから4msの間で変化させ、培養物を焼くことなく効果的な刺激を引き起こします。振幅が± 22 Vのオーダーであることを確認します(図3を参照)。矩形パルスは、電極に並列に接続されたオシロスコープで観察できます.
      手記：目的の波形を簡単にプログラミングするには、市販の波形編集ソフトウェアを使用してください(材料リストを参照)。目的の波形をグラフィカルに入力し、波形発生器に送信します。
2. 電界の均一性をテストするには、プローブ電極を使用します。少なくとも1 mm x 1 mmのグリッドを使用して、プローブを電極間の領域に移動させ、電位を測定できるようにします。
   1. 電位を測定します。電界を計算するには、を使用します。電極の1つを基準電極として使用します。100 μs から 4 ms の間で変化するパルス幅で電界を測定し (100 μs のパルス幅の例については図 3B を参照)、刺激持続時間の範囲内で磁場が均一であることを確認します。
      手記：パルス幅が1msの場合に測定された電界の均一性の例については、図3Dを参照してください。

結果

図1:同期ネットワークバースト中に画像化されたカルシウム過渡現象のトレース例。実験前にカルシウム色素で染色したニューロンの画像。イ. A の ROI の強度と時間のトレースと、トレースの色が A の ROI の境界の色を表します。3つのROI内で同期された強度の大幅な増加は、ネットワークバーストを表します[図2を挿入]

図2:神経細胞培養の磁気刺激に使用されたセットアップの概略図。上部には、ニューロンリング培養物の5mm上に同心円状に配置されている磁気コイル(青い円...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化カルシウム , 1M	フルーカ	21098	細胞外記録ソリューション。
D-(+)-グルコース、1M	シグマ・アルドリッチ	65146	めっき媒体、細胞外記録液。
ヘペス、1ヶ月	シグマ・アルドリッチ	H0887-J	細胞外記録ソリューション。
KCl、3か月	メルク	1049361000	細胞外記録ソリューション。
塩化マグネシウム , 1M	シグマ・アルドリッチ	M1028	細胞外記録ソリューション。
NaCl、4M	バイオラボ	19030591	細胞外記録溶液。
ショ糖、1M	シグマ・アルドリッチ	S1888	細胞外記録ソリューション。
電極ワイヤー	AMシステムズ、カールスボーWA	767000	ニューロン培養の電気刺激。
信号発生器	BK評価	4079	電気信号の整形。
増幅器	ホームメード		信号発生器から電極への信号の電圧増幅。
電源	行列	MPS-3005 LK-3	スパッタリング装置への電源供給
プラチナ線 0.005インチ厚;A-Mシステムズ、	ワシントン州カールスボー	767000	ニューロン培養の電気刺激。

名