磁場によるパターン化した神経細胞培養の刺激

要約

出典:Stern, S., et al., External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、時間とともに変化する磁場を使用して、カバーガラス上のパターン化された円形リングで成長したニューロン培養を刺激する方法を示しています。

プロトコル

1. 1D培養用のカバースリップの準備。

1. 75mLの重水素減少水、25mLの25%アンモニア溶液、および25mLの30%過酸化水素からなる塩基性のピラニア溶液に浸すことにより、ガラスのカバーガラスをきれいにします。ガラスカバーガラスを載せた溶液を加熱プレート上に~50°Cで30分間置き、ガラスカバーガラスを窒素で乾燥させます。
2. まず、カバーガラスを厚さ6 Åの薄いクロムフィルム(99.999%)でコーティングし、続いて30 Åの金層(99.999%)を蒸着またはスパッタリングでコーティングします。
   1. 0.05 – 1 Å /sのスパッタリング速度を達成するには、2つの電子ビームと260 l/sの真空システムを備えたスパッタリング装置を使用し、ターゲットサイズは2インチと4インチです。毎分 0 から 100 ラウンド (RPM) までの回転ステージを使用します。0〜750ワットの直流(DC)スパッタ電力を使用してください。
   2. チャンバー内で10mTorrの圧力でプラズマを得るには、デバイスを30rpmで回転させ、99.999%でアルゴンを使用します。
   3. スパッタリングガンの電源を、クロムの場合は40 W DCスパッタ電力で操作すると、カバー率は~0.12 Å/sになり、金の場合は10 W DCスパッタ電力で~0.28 Å/sになります。
3. 超音波を30分間使用して、0.1gの1-オクタデカンチオールを100mlのABSarエタノールに溶解します。Cr-Auコーティングされたカバーガラスをこの溶液に2時間置き、エタノールABS ARで洗浄し、窒素で乾燥させます。
4. 100 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)と3.5 gのトライブロック共重合体(材料/試薬の表を参照)の溶液を、600〜700 rpmで1〜2時間撹拌して調製します。カバースリップを溶液に1時間置きます。カバースリップを窒素で乾かします。
5. バイオリジェクション層を傷つけることで、目的のパターンを機械的にエッチングします。これを行うには、ペンをエッチング針に置き換えたペンプロッターを使用します。金属層を通してパターンを引っ掻いて、下にあるガラスに到達します。このプロセスをコンピューターで制御して、目的のパターンをレプリケートします。このプロセスによって形成されるパターンを図1と図2に示します。
6. 100 mL D-PBS、3.5 gのトライブロック共重合体、35.7 μL/mLフィブロネクチン、および29 μL/mLラミニンの生体適合性層を調製します。
   1. カバースリップを紫外線で少なくとも10分間滅菌し、調製した生体適合性溶液でカバースリップを一晩インキュベートします
      注:生体適合性層は、前のステップで生体拒絶層がエッチングされた場合にのみ形成されます。
   2. 翌日、カバーガラスをP-DBSで2回洗います。それらをPMで一晩インキュベートします。これで、カバースリップをセルめっきする準備が整いました。

2. ニューロン培養の維持。

1. (mLあたり):0.9 mL MEM + 3G、0.1 mL HI HS、10 μL 5-フルオロ-2′-デオキシウリジン(FUDR)とウリジン100xで構成される交換培地(CM)を準備します。
2. (mLあたり)0.9 mL MEM + 3Gおよび0.1 mL HI HSで構成される最終培地(FM)を調製します。
3. 4日後、in vitro(DIV)でPMを1〜1.5mL CMに交換します。6 DIV で、CM の 50% を新しい CM に置き換えます。DIV 8では、ミディアムを1.5 mL FMに変更し、続いて2日ごとにFMを50%変更します。約1週間後、自発的な同期活動が現れます。

3. 蛍光色素によるニューロン培養における自発的または誘発的な活動のイメージング。

1. 50 μL DMSO(ジメチルスルホキシド)に50 μgのカルシウム感受性蛍光色素(材料/試薬の表を参照)の溶液を調製します。
2. 10 HEPES、4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、139 NaCl、10 D-グルコース、45スクロース(pH 7.4)を含む細胞外記録溶液(EM)を調製します。
3. 2 mLのEMでニューロン培養物を8 μLのカルシウム感受性蛍光色素溶液と1時間インキュベートします。光から保護し、ゆっくりと回転させて、色素が細胞に均一に広がるようにします。
4. イメージングする前に、溶液を新しいEMと交換してください。蛍光イメージングを図3に示します。
5. 顕微鏡の視野内の任意の関心領域(ROI)の強度を定量化できるカメラとソフトウェアを使用して、カルシウム蛍光イメージング用の光学フィルターを備えた蛍光顕微鏡(励起ピーク488nm、発光ピーク520nm)で画像化します。

4. 培養物の磁気刺激

>注:磁気刺激の基本的な設定を図1に示します。右上には、ニューロン内のカルシウム感受性色素を画像化するために使用される倒立蛍光顕微鏡が示されています。磁気コイル(青い円)は、ニューロンリング培養物(青い輪郭)から同心円状に約5mm上に配置されています。ペトリ皿の円周にあるピックアップコイル(赤丸)は、磁気パルスによって誘導される電圧を監視します。左上には、ピックアップコイルから積分されたコンデンサ電圧負荷が5,000kVの磁気刺激装置(MS)コイルの測定されたダイナミクスが示されています。誘導電界(リング半径14mmで計算)は緑色で、磁場は青色で示されます。下部には、ニューロン培養の画像が示されています。左下は、パターン化された24mmのカバースリップの明視野画像です。白い領域はニューロンです。撮影されたパターンは、半径の異なる同心円状のリング文化で構成されています。右下には、リングの短いセグメントにズームがあり、個々のニューロンが示されています。スケールの場合、リングの幅は約200μmです。

1. ニューロンを円形のリングパターン(1.5で説明されているようにエッチング)で成長させ、1D培養刺激を行います。カルシウムイメージングにはカルシウム感受性蛍光色素を使用し(セクション3を参照)、細い(170 μm)長い(10 mm)ライン上にパターン化された1D培養を行います。
   1. 円形の磁気コイルを使用し、ペトリ皿を約5mm下に、コイルと同心円状に配置します。インダクタンスL=90mHの約30mm(内径、外径46mm)のカスタムコイルを、最大電圧5kVの自家製または市販のMSで駆動します。
   2. 神経細胞の培養物を磁気的に刺激するために、高電圧と電流を高電流-高電圧スイッチを使用して導電性コイルに放電します。磁気刺激装置(MS)は、100mF程度の大型コンデンサを使用して構築でき、1〜5kVの高電圧を得ることができます。または、市販のMSを使用してください(材料/試薬の表を参照)
      手記： 厚さ0.254mm、幅6.35mmのポリエステル被覆長方形銅線を使用して、自家製コイルを製作します。カスタムメイドのフレームにワイヤーを巻き付け、ガラス繊維で絶縁し、エポキシ樹脂で鋳造します(材料/試薬の表を参照)。または、市販のコイルを使用してください(材料/試薬の表を参照)。

結果

図1:ニューロン培養の磁気刺激に使用されたセットアップの概略図。上部には、ニューロンリング培養物の5mm上に同心円状に配置されている磁気コイル(青い円)が示されており、ペトリ皿(青い輪郭)に配置されています。ペトリ皿の円周に配置されたピックアップコイル(赤丸)は、磁気パルスによって誘導される電圧を測定します。下部には、磁気刺激コイルの測定されたダイナミクスが示されています(5,000 kVのMSコンデンサ電圧負荷を使用)ピックアップコイルから積分されたものとして。誘導電界(リング半径14mmで計算)は緑色で、磁場は青色Bで示されています。倒立顕微鏡では、磁気パルスに反応するニューロンのカルシウム過渡現象に敏感な蛍光色素を画像化します。C.同心円状のリングのパターンで成長したニューロンは、リング磁気刺激装置による効果的な刺激に使用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CaCl2 , 1M	フルーカ	21098	細胞外記録ソリューション
D-(+)-グルコース、1M	シグマ・アルドリッチ	65146	めっきメディウム、細胞外記録液
D-PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8537	細胞培養
フィブロネクチン	シグマ・アルドリッチ	F1141	バイオコーティング
Fluo4、午前	ライフテクノロジー	F14201	自発的または誘発された活動のイメージング
FUDR	シグマ・アルドリッチ	F0503	メディアの変更
ゲンタマイシン	シグマ・アルドリッチ	G1272	めっき媒体、チェンジング媒体、最終媒体。
ヘペス、1ヶ月	シグマ・アルドリッチ	H0887-J	細胞外記録ソリューション
ハイHS	BIの	04-124-1A	めっき媒体, チェンジングメディウム, ファイナルメディウム
KCl、3か月	メルク	1049361000	細胞外記録ソリューション
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020	バイオコーティング。
MEM×1	ギブコ	21090-022	めっき媒体, チェンジングメディウム, ファイナルメディウム
塩化マグネシウム , 1M	シグマ・アルドリッチ	M1028	細胞外記録ソリューション
NaCl、4M	バイオラボ	19030591	細胞外記録ソリューション
オクタデカンチオール	シグマ・アルドリッチ	1858	Cr-Auコーティングされたカバースリップのクリーニング(1D培養)
ショ糖、1M	シグマ・アルドリッチ	S1888	細胞外記録ソリューション
ウリジン	シグマ・アルドリッチ	U3750	メディアの変更
スパッタリング機	AJAインターナショナル株式会社	ATC オリオン-5シリーズ	ガラスを薄い金属層でコーティング
ペンプロッター	ヒューレット・パッカード	HPの7475A	コーティングされたカバースリップへのパターンのエッチング
電源	行列	MPS-3005 LK-3	スパッタリング装置への電源供給
エポキシ	コグニズム	バーサミッド140	自家製コイルの鋳造
エポキシ	貝	エポン815	自家製コイルの鋳造

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