多電極アレイを用いた3D共培養球のシナプス生理機能の測定

要約

出典:Cvetkovic, C., et al.ヒト多能性幹細胞からのアストロサイトとニューロンの3D共培養によるシナプス微小回路モデリング。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、多電極アレイ(MEA)を使用して3D共培養球のシナプス生理機能を測定する手順を示しています。この方法により、3D球体内のニューラルネットワークダイナミクスとシナプスネットワークバースト活動を理解することができます。

プロトコル

多電極アレイ(MEAs)によるシナプス生理の生測定

1. 細胞培養用のMEAを準備します。

1. 滅菌脱イオン(DI)水ですすぎ、70%エタノールですすぎ、滅菌した後、バイオセーフティキャビネットでUV光の下で風乾します。
   手記： MEAは、使用するまで無菌条件下で4°Cの脱イオン水に保存できます。
2. ポリオルニチン(PLO)の0.5 mg/mL溶液を調製し、50 mgのPLOを100 mLのホウ酸緩衝液に溶解します。各MEAの表面に1 mLのPLOをコーティングして親水性にし、37°Cで最低4時間インキュベートします。PLOを取り外し、表面をDI水で洗います。
3. 細胞外マトリックス(ECM)コーティング溶液を基礎(DMEM/F12)培地で希釈し、1 mg/mLのストック溶液を調製します。ワーキングソリューションとして、3 mLのECMストックを33 mLの予冷済みDMEM/F12培地に再懸濁し、総容量を36 mLにして80 μg/mLの濃度にします。
4. 各MEAに1 mLのECMワーキング溶液を加え、37°Cで最低4時間インキュベー
トします。
5. ECMを取り外し、球体をMEA表面上の1.5mLの培地に置き、球体が電極アレイの上部に配置されていることを確認します(図1A、1A')。メディアが2日間付着するのを待ちます。メディアの半分を2〜3日ごとに(または必要に応じてそれ以上の頻度で)交換し、球体が乱されないようにします。
   手記：成長因子の添加により、培養物の生存率と成熟が向上する可能性があります。

2. 神経球の電気的活動を測定します。

1. 温度制御されたヘッドステージを備えた多電極アレイ(MEA)システムをセットアップします。5 Hz のハイパス フィルタ、200 Hz のローパス フィルタ、5 倍の標準偏差 (SD) のスパイク閾値を持つソフトウェア プログラムを作成します。
2. MEAをヘッドステージに置き、自発的な電気的活動を記録します(図1B、B ')。スパイク周波数や振幅などの生データを統計解析用に保存します。
   手記：灌流システムは、薬理学的薬剤を追加したり、長期記録のために新鮮な培地の流れを増やしたりするために、MEAとともに利用することができます。必要に応じて、スパイクの追加の後処理を行ってもよい。

結果

図1:多電極アレイ(MEA)上の神経球の代表的な生きたシナプス生理学。 (A、A')MEAは、神経球の生きたシナプス生理機能を測定するために利用されます。iNeuronsの球体(A)またはiNeuronsとhAstrosの共培養(A')は、ECM模倣基質を用いてMEA表面上で培養することができます(ステップ4.1を参照)。(B、B')記録ウィンドウ(横軸)中にすべての電極(縦軸)で測定された代表的な自発的な電気的活動のラスタープロット。神経生理学的基礎培地41での4週間の培養後、iNeuron球体(B)は自発的なスパイクを示し、共培養球体(B')は同期発火パターン(オレンジ色の矢印)のネットワークバーストの増加を示した。(C、C')代表的な電極からのMEA記録ウィンドウ中に測定されたスパイクのヒ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	サーモフィッシャー	〒10565-042	GlutaMAXサプリメント付き
アンチ/アンチ	サーモフィッシャー	15240062
B27	サーモフィッシャー	17504044	メディアサプリメント
ヘパリン	シグマ	H3149-50KUさん	使用濃度:2 mg/mL
マトリゲル膜マトリックス	コーニング	354230	ECMコーティングソリューション。使用濃度:80 ug / ml。氷上で準備し、ピペット、チューブ、およびメディアが事前に冷やされていることを確認してください。
MEA 2100システム	マルチチャネルシステム	MEA2100
N2	サーモフィッシャー	17502048	メディアサプリメント
ポリ-l-オルニチン(PLO)	シグマ	P3655-100MG	使用濃度:0.5 mg/mL

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